DIAGRAMA CONCEPTUAL . ARTICULO 2

Flussdiagrammknoten

• Purificación, caracterización y cinética del inhibidor de la proteasa de frutos de Solanum aculeatissimum Jacq (Articulo 2)

• Purificación de SAPI

•   Ensayo de actividad inhibidora de la proteasa

•   Se homogeneizaron 100 g de frutas frescas.con 250 ml de tampón Tris salino (20 mmol / l Tris, pH. 8.0; 0,15 mol / l de NaCl) que contiene 1% de polivinilpirrolidona.

•   La actividad SAPI se determinó estimando la actividad hidrolítica residual de tripsina y quimotripsina hacia los substratos BAPNA (N-benzoil-1-arginina-p-nitroanilida) y BTPNA (N-benzoil-1-tirosil-p-nitroanilida), respectivamente, atpH 8,0 después del pre -incubación con inhibidor

•   SDS, Native-PAGE y enfoque isoeléctrico

•   SEfecto de la temperatura y el pH

•   Análisis cinético

•   Efecto de iones metálicos, detergentes, oxidantes y reductoresagentes en la actividad PI

•   Dicroísmo circular

•   Modificación química de los residuos de aminoácidos de SAPI

•               La masa molecular y la pureza de PI se  evaluaron mediante SDS-PAGE y Native-PAGE según el protocolo de Felicioli et al. La masa molecular se confirmó posteriormente mediante cromatografía de elución de tamaño. En electroforesis se realizó con placas de gel de poliacrilamida Ampholine de Pharmacia (rango de pH 3-11) junto con el kit de calibración de pI de rango amplio de Pharmacia que contiene proteínas con diversos puntos isoeléctricos que varían de 3 a 10. Las proteínas se tiñeron con método de nitrato de plata.

•              El efecto de la temperatura sobre la tripsina o la actividad inhibidora de la quimotripsina se evaluó incubando SAPI durante un baño de agua de 30 min a un rango de temperatura de 10-100 ° C, y luego se enfrió antes de probar la actividad inhibidora residual.

•           El análisis cinético de la actividad SAPI se llevó a cabo siguiendo el protocolo del análisis de la trama Dixon. Concentraciones como 4, 5, 6, 8, 10 y 12 nmol / L se usaron para determinar la constante de inhibición (Ki). El potencial inhibidor de IP se analizó para tripsina y quimotripsina usando BAPNA (0,005 y 0,01 mmol / l) y BTPNA (0,5 y 1 mmol / l). 

•        Se estudió el efecto de los agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno y el dimetil sulfóxido sobre la actividad de PI incubándolos con 0,5, 1, 2, 3 y 4% (v / v) durante 30 minutos y posteriormente se estimaron las actividades inhibidoras residuales. De forma similar, el efecto de los agentes reductores como ditiotreto (DTT) y β-mercaptoetanol sobre las actividades de PI se analizó incubando SAPI con 1, 2 y 3 mmol / l durante 3 hy se estimaron sus actividades inhibidoras residuales.

•              Espectropolarímetro Jasco equipado con cámara de flujo detenida y soporte de celda termostatizado con ancho de banda de 1 nm, velocidad de barrido de 50 nm / min a una longitud de celda de 0.2 cm y temperatura de 25 ° C (más de tres acumulaciones) en 10 mmol / l de Tris- HCl, pH8 son los parámetros empleados para analizar las características estructurales nativaS. Se registraron diferentes mediciones espectrales de CD para SAPI nativo  siguiendo la metodología de Leach and Fish. Se observó la elipticidad molar y, posteriormente, el porcentaje de la estructura secundaria se predijo utilizando el programa k2d.

•                    Para analizar los aminoácidos en el sitio reactivo de la molécula inhibidora relacionada con su actividad de PI se midió mediante modificadores químicos específicos y se determinó el efecto de los modificadores sobre la actividad antiproteolítica de la molécula inhibidora. Se utilizó el protocolo de Patthy y Smith para analizar la modificación de los arginina-residuos con 1,2-ciclohexanodiona (CHD). SAPI en 50 mmol / l de tampón de borato (pH 9.0) se incubó con 15 veces el exceso molar de CHD y el vial de reacción se lavó con nitrógeno y se mantuvo a 37 ° C durante 2 h. La reacción se terminó mediante la adición de ácido acético al 5%. Los residuos de lisina se modificaron utilizando anhídrido succínico siguiendo el protocolo de Hayneset al.