FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN

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• La fotocolorimetría

• método para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática.

• Consiste en medir la intensidad de luz absorbida (A)  por una solución coloreada de uno o varios compuestos.

• La absorción máxima ocurre a una longitud de onda, varía proporcionalmente con la concentración del compuesto en una solución.

• Absorción de energía por sustancias coloreadas

• El espectro electromagnético abarca diferentes longitudes de onda, que van desde las ondas de radio hasta rayos gamma.

• Se sabe que a menor longitud de onda , mayor frecuencia y por tanto mayor energía.

• Dependiendo de la frecuencia (energía) de la región del espectro, se afecta a las moléculas de diferentes formas.

• Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiación electromagnética.

• El color que se observa es una combinación de las longitudes de onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.

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• Espectro de absorción

• Para saber  la energía de las transiciones  en una molécula cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario trazar una gráfica.

• Donde se relacione la intensidad de energía que se va absorbiendo en la región del espectro que nos interesa

• Se llama espectro de absorción, y se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energía.

•  El conocimiento de la precisión la energía  de la transición de máxima absorción facilita la detección de la sustancia.

• Facilitar la detección de la sustancia permite determinar su concentración o para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.

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• Energía absorbida y concentración (ley de Beer)

• La intensidad de la energía absorbida depende del número de moléculas que sufren la transición electrónica a la onda  seleccionada.

• calcula la concentración de una muestra problema, midiendo la absorbancia de la muestra patrón (Apat.) y de la muestra problema (Aprob.). 

• Depende a su vez de la concentración de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:

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•  Tanto a las soluciones patrón como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las soluciones patrón se construye la curva de calibración (A vs. C).

• Las absorbancias de las muestras problema por interpolación de la curva, permiten calcular las concentraciones.

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• Cuantificación de proteínas

• Se puede dar por los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos.

• También se puede dar por la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, entre otras.

• En la reacción de Biuret las sustancias que contengan dos o más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta.

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• Espectrofotómetros

• permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgánicas.

• equipos  diseñados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un compuesto en una solución.

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