Determinación de Malondialdehido (MDA) en muestra de tejido vegetal

Flussdiagrammknoten

• Determinación de Malondialdehido (M.D.A.) en muestra de tejido vegetal

• En la prueba de reacción del ácido tiobarbutírico (TBA) para detección de malondialdehido (MDA), una molécula de MDA reaccióna con dos moléculas de TBA, produciendo una sustancia (MDA+((TBA)2)) de pigmentación rosa con una absorbancia máxima a 532-535 nm.

• La reacción debe ser llevada a cabo a un pH 2-3, a 90-100 ° por 10-15 min.

• Para precipitar las proteínas, usualmente el tejido muestra es mezclado con dos volúmenes de ácido tricloracético frío al  10% (m/v)

• Por medio de la centrifugación, el precipitado es transformado en pellets o gránulos

• Una alícuota del sobrenadante es tomada y se hace reaccionar con un volumen igual de 0.67% (m/v) TBA en un baño de agua en ebullición por 10 min.

• Después de dejar enfriar la muestra, se lee la absorbancia a 532 nm y la concentración de MDA es calculada usando el valor base de 153,000.

• El reactivo TBA debería ser preparado como una solución acuosa y requiere calor para disolver el TBA sólido.

• Una curva de estandarizacion puede ser preparada usando malonaldehido bisdimethil o bisdiethilacetal como fuente de MDA

• Una solución stock es preparada al adicionar 1 mmol de acetal a 100 ml de ácido sulfúrico al 1% (v/v) y dejando la mezcla en un cuarto temperado por 2 hr para lograr la hidrólisis completa.

• Para la preparación de la curva de estandarización, el stock de MDA está diluido entre 1- 10/~M  y luego reaccióna con el TBA.

• Hidroxitolueno butilado (BHT) y EDTA se añaden a la muestra y mezcla de reacción para minimizar la oxidación de lípidos.

• La temperatura de reacción de las muestras tiene que ser reducida para minimizar la descomposición de las hidroperoxidasas lipidicas

• Reactivos (almacenarlos de 2-8 °C): 2- Ácido thiobarbiturico, en polvo, 5 botellas Hidroxitolueno butilado en etanol, 2.0 mL vial 1M de ácido fofórico, 5 x botellas de 10 mL Buffer de fosfato, a de pH 7.0 con EDTA, botella de125 mL Tetrametoxipropano en un buffer estabilizador a 4,3,2,1 y 0 µM equvalentes de MDA; de 2.5 mL cada uno Materiales analíticos: Pipetas ajustables con capacidad de volúmenes de10 y 250 µL Puntas de pipeta para pipetas de volúmenes de10 y 250 µL  ​Barra para agitar, de más o menos 0.3 cm Tubos de microcentrífuca de polipropileno Semi-micro cubetas (plásticas, de vidrio o cuarzo) Agua deionizada Spectrofotometro  Vortex  Agitador magnético Bloque de calentamiento en seco o baño maría a 60°C Microcentrifuga

• Preparación del TBA

• Añadir 10.5 ml de agua deionizada a un vaso de precipitado con TBA

• Introducir en el vaso de precipitados lo imanes del agitador magnético y mezclar en el agitador durante aproximadamente 10 min, hasta disolver todo el TBA.

• Almacenar el TBA reconstituido a temperatura ambiente y NO refigreara.

• Ácido tiobarbituric (TBA) 99% Sal de tetrabutilamonio de Malondialdehido (sal de MDA) al 96% Methanol al 99.8% Ácido acético glacial al 99% Agua destilada y desionizada con menos de 5 mΩ

• Preparación de solución estandar de TBA a 4.0 mM

• Disolver 57.66 mg de TBA en 100ml de ácido acético glacial en un vaso de precipitados

• Preparación de la solución madre de MDA y las diluciones de calibración

• Disolver 31.35 mg de sal de MDA en 100ml de ácido acético glacial en un vaso de precipitados para formar la solución madre

• Preparar cinco diluciones de la solución madre a 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8mM

• Con los valores del espectofotómetro, preparar una curva de calibración 

• Preparación de la muestra

• Diluir un gramo de la muestra macerada en 5ml de solvente (ácido acético glacial al 100% o ácido acético glacial al 50% en agua), en un tubo de ensayo de 25ml. Se puede usar BHT al 0.01% para evitar la oxidación temprana del medio.

• Agitar por una hora

• Filtrar

• Centrifugar lo filtrado

• Tomar de cada dilución 1ml y mezclar con 1ml de solución estandar de TBA

• Calentar las muestras en un baño maría a 95°C por 60 min

• Dejar reposar las mezclas hasta que alcancen la temperatura ambiente

• Medir la absorbancia de las mezclas y una muestra blaco (de agua o ácido acético) a 532 nm en el espectofotómetro

• Mezclar 1 ml de la muestra procesada con 1 ml de solución estandar de TBA

• Calentar las muestras en un baño maría a 95°C por 60 min

• Dejar reposar las mezclas hasta que alcancen la temperatura ambiente

• Medir la absorbancia de las mezclas y una muestra blaco (de agua o ácido acético) a 532 nm en el espectofotómetro

• Calcular las sustacias reactivas al ácido tiobarbutirico o TBARS

• Ensayo de TBA/TCA para determinación de Malondialdehido (M.D.A.) en muestras de tejido vegetal

• Preparación de solución estandar de TBA al 0.5% en TCA al 20%

• Diluir 20 g de la TCA en 80 ml de agua destilada y deionizada, en un vaso de precipitados

• Añadir 0.5 g de TBA a la mezcla

• Poner un plato de vidrio sobre el vaso de precipitados

• Calentar el vaso de precipitados a 80 °C y agitar, todo dentro de una campana de extracción. Mantener durantre 30 min o hasta disolver el TBA

• Dejar reposar la mezcla hasta que alcancen la temperatura ambiente

• Transferir la mezcla a un frasco volumétrico de 100 ml y ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada y deionizada

• Preparación de solución estandar de TCA al 0.1%

• Diluir 0.1 g de la TCA en 100 ml de agua destilada y deionizada, en un vaso de precipitados

• Preparación de la muestra y su réplica

• Sacar la muestra del congelador a -80°C e ingresarla en nitrógeno líquido, en un tubo de ensayo

• Añadir dos cuencas de carburo de tugsteno e ingresar la muesta en el mixer mill por 3.5 min a 30Hz

• Trabajando en hielo, sacar las muestraas y añadir 1ml de TCA al 0.1 %

• Mezclar en el vortex hasta homogeneizar

• Centrifugar la mezcla durante 10min a 13000rpm, a 4°C para formar un pellet

• Pincha un hueco con una aguja de jeringa en la tapa de un tubo ependorf de 2 ml

• En el tubo pinchado ingresar 1 ml de solución estandar de TBA al 0.5% en TCA al 20% y añadir 400 ul de muestra procesada (400 ul de solución estandar de TCA al 0.1% para el blanco). Esta es una dilución en 3.5 veces

• Cerrar las tapas pinchadas e incubar por 30 min a 80 °C en baño maría o bloque de calentamiento en seco

• Al terminar el tiempo de incubación, ingresar los tubos a hielo y esperar 5 min o hasta que tengan una temperatura similar al hielo 

• Centrifugar la mezcla durante 5 min a 13500rpm, a 4°C para formar un pellet de cualquier TBA precipitado

• Transferir 200 ul de sobrenadante a los platos 96 buenos. Recuerda hacer una réplica

• Medir la absorbancia a 532 y 600 nm

• Calcular el MDA