P2 Extracción DNA

Flussdiagrammknoten

• Extracción de DNA plasmídico 

• Lisis alcalina

• Hacer cultivo E.Coli 3-5 ml con antibiótico

• Dejarlo crecer a 37°C en agitación

• Cosechar las células por centrifugación

• Descartar el sobrenadante

• Lavar paquete celular

• 1 ml MgSO4 10mM

• Centrifugar a 13,000 rpm

• Desechar el sobrenadante

• 3 min a 6000 rpm

• Purificación de Plásmido con Sílica

• Resuspender la pastilla en S.I (pH7) helada

• Dar vortex hasta resuspender el paquete

• Agregar la S.II (pH.B) y mezclar 

• Agregar S.III (pH.A), agitar e incubar 10 min en hielo

• Centrifugar 10 min a 13,200 rpm

• Recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo

• + 450 μl de buffer NaI 6M)

• Vortexear, dejar reposar 5 min

• Resuspender sílica y agregar 10μl

• Centrifugar 1 min a 12,000 rpm.

• Descartar el sobrenadante.

• Lavar pastilla con 700μl buffer New Wash (4)

• Resuspender la pastilla

• Repetir  3 veces, Centrifugando 1 min a 12,000rpm

• Remover todo el sobrenadante

• Dejar secar pastilla 5 min a 37°C

• Resuspender la pastilla en 20 μl de Rnasa diluida

• Incubar 1h a 37°C

• Centrifugar a 13,200 rpm

• Recuperar sobrenadante en un tubo eppendorf nuevo

• Centrifugar 2 min a 13, 200 rpm

• Secar la pastilla por 5 min a 37°C

• Extracción de plásmido por Calor-NaClO4

• Centrifugar 3 ml de cultivo

• Resuspender en 175 μl de sol TES

• Agregar 25 μl de lisozima (10 mg/ml)

• Mantener 20 min en hielo

• Agregar 400 μl de agua helada

• Incubar 15 min a 73°C

• Centrifugar 15 min a 12000 rpm

• Transferir el sobrenadante en un tubo nuevo

• Agregar 60 μl de NaClO4 5M

• Agregar 600 μl de Isopropanol, mezclar

• Centrifugar 15 min a 12000 rpm

• Lavar el pellet con 600 μl de etanol al 70 % 2 veces

• Secar y resuspender en 30 μl de RNAsa diluida.