Métodos básicos da Biologia Molecular 1

PCR - exame em cadeia da polimerase:
1. APLICAÇÕES
  1. 7ª: Diagnósticos de doenças infecciosas
  2. 6ª: Grande potencial na Medicina Forense (Finger Print)
  3. 5º: Diagnósticos pré-natal em casos de risco -Evitar doenças graves
  4. 4º:Detecção de mutação em genes específicos- Diagnóstico precoce
  5. 2º:Sequenciamento direto de produtos amplificados
  6. 1º: Estudo do padrão de expressão gênica
  7. 3º: Seleção de clones recombinantes
2. ETAPAS = termociclador = +-24 a 40 ciclos=a cada ciclo novas fitas são formadas
  1. 3ª - POLIMERIZAÇÃO (72°c):Temperatura ótima para funcionamento da DNA polimerase (TAQ’s)  reconhecem os primers e começam o processo de replicação do DNA, até pararem pela alteração no ciclo( variação da temperatura)
  2. 2ª - ANELAMENTO (37-65°C): Liga o primer a fita de DNA
  3. 1ª - DESNATURAÇÃO (94-65°c): Temperatura necessária para desfazer as ligações de H da dupla fita de DNA
3. FRAGMENTO DE DNA ALVO : O que eu quero analisar Localizado entre “dois iniciadores” (primers).
  1. PRIMER DE DNA (comprado): São projetados de modo que um é complementar para cada lado da dupla hélice do DNA . Seleciona o gene a ser replicado. Estão nos bancos de dados, graças ao Projeto Genoma Humano .
4. DEFINIÇÃO: Técnica utilizada na biologia molecular para AMPLIFICAR uma única cópia ou algumas cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA.
  1. Forma de estudo de um gene específico. Técnica extremamente sensível, rápida, barata, e que requer o mínimo de amostras do paciente.
5. COMPONENTES DO PROCESSO:
  1. PCR amplifica uma sequência alvo, se baseando no processo de replicação do material genético, ele vai replicar uma região específica do DNA, com várias e várias copias. Logo, para fazer o PCR é necessário:
    1. DNA POLIMERASE- TAQ DNA Polimerase: enzima advinda de uma bactéria que vive em altas temperaturas; ideal para amplificar o DNA a partir do anelamento com os primers em temperaturas intensas , sem desnaturar facilmente a enzima .
    2. PRIMER: apresenta OH livre na porção 3’ para reconhecimento/leitura da DNA polimerase; sempre sintetizado observando a porção 3’-5’ do DNA
    3. NUCLEOTÍDEOS: DNA do paciente ou do alvo)
    4. CLORETO DE MAGNÉSIO: cofator para a DNApolimerase, favorece e acelera seu funcionamento.
    5. OBS: Primase (enzima que retira os primers) não é necessária: o primer (de DNA) vai ser desenhado pelo técnico para o local específico de entrada, não sendo necessário sua retirada.
6. O PCR sozinho não diz nada, precisa ser usado em conjunto com um método de análise, como a eletroforese
ELETROFORESE:
1. DEFINIÇÃO: A eletroforese é uma técnica laboratorial realizada com o objetivo de separar moléculas de acordo com o seu tamanho e carga elétrica para que se possa ser realizado o diagnóstico de doenças, seja verificada a expressão de proteínas ou se possa identificar microrganismos.
2. PROCESSO: A técnica consiste na migração de moléculas em função da aplicação de um campo elétrico. A princípio a mostra é aplicada em gel e a fonte de eletroforese cria a corrente elétrica que ocasiona a sua migração, quanto maior a molécula, mais lento é este processo, assim, moléculas de diferentes tamanhos realizam este trajeto de um pólo a outro em tempo e velocidades distintos. A distância que o fragmento percorreu é comparada a um padrão e as bandas irão guiar o pesquisador durante a análise. Para a visualização, é utilizado um corante que sob a luz UV de um transiluminador emite fluorescência e permite a leitura das bandas.
  1. Ao comparar a distância de migração de fragmentos desconhecidos com a distância viajada pelos padrões de tamanho, pode-se determinar o tamanho aproximado dos fragmentos desconhecidos. Por comparação, podemos inferir se o primer se anelou corretamente no processo de PCR, pois encontrou-se um tamanho de gene que está dentro da expectativa.
  2. Se na eletroforese deu tamanho aproximado entre as bandas, é provável que o teste deu certo.
  3. Contudo, não se sabe quais são as bases nitrogenadas encontradas, ou seja, não tenho uma sequência de bases para o gene especifico que me dê a resposta do problema que quero resolver, para isso é preciso ampliar a eletroforese e o sequenciamento que vai me dar os nucleotídeos.
3. APLICAÇÕES:
  1. A eletroforese é utilizada em inúmeros processos de biologia molecular, entre eles: · Ciência forense– para comparar o DNA encontrado no local do crime com o de possíveis suspeitos. · Genética– teste de paternidade, diferenciação de espécies ou linhagens e engenharia genética. · Microbiologia– detecção de diferentes patógenos como vírus, bactérias e fungos. · Bioquímica– detecção da expressão de proteínas.
MARINA BATISTA LIMA - PUC MG - T19- GENÉTICA- ANNA CAROLINA DE FREITAS POLICARPO
Exame RT- PCR:
1. DEFINIÇÃO: Técnica feita para obter clones genômicos ou de *cDNA, adicionando um passo que antecede os ciclos de PCR *cDNA = Dna Complementar → DNA fita simples reproduzido através de um RNA complementar a este
2. PROCESSO: DNA Polimerase não usa RNA como cópia . Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA em DNA convertido (RNAm convertido em DNAc) por meio da RT . RT é Reverse Transcriptase: usado quando parto do princípio que quero estudar RNA . Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com o PCR
3. ETAPAS:
  1. 1º: Extrai-se RNA ao invés de DNA 2ª: PCR para amplificar o gene alvo 3ª: Transcriptase reversa + primer- que anela e faz a transcrição. 4ª: Resultado é um DNAc de todo o DNA . 5ª: Basta colocar o primer especifico e teremos a sequência de DNAc que se queria
4. APLICAÇÕES: A PCR pode ser utilizada para detectar a presença de um genoma de vírus em uma amostra de sangue. Devido à sua capacidade de amplificar muito o sinal a partir de cada molécula única de ácido nucleico, a PCR é um método extraordinariamente sensível para detectar quantidades mínimas de vírus em uma amostra de sangue ou tecido sem a necessidade de purificar o vírus.
  1. Para o HIV, o vírus causador da Aids, o genoma é uma molécula de RNA de fita simples. . Vários outros vírus que infectam humanos são agora detectados dessa maneira.
REAL TIME PCR:
1. DEFINIÇÃO: Quantificação em tempo real . É uma variação simples do PCR, onde temos uma modificação da reação em cadeia da polimerase, que determina de forma quantitativa o ácido nucleico inicial, na qual a quantidade de DNA amplificada é verificada à medida que a reação prossegue.
  1. A PCR Real Time baseia-se na detecção da fluorescência emitida por uma molécula repórter que aumenta à medida que a reação avança. O aumento da fluorescência ocorre devido ao acúmulo do produto de PCR (fragmento alvo) a cada ciclo de amplificação. A PCR Real Time facilita o monitoramento da reação à medida que ela progride. Pode-se detectar quantidades extremamente mínimas de ácido nucleico do patógeno investigado e quantificar o produto final com precisão.
  2. Além disso, não há necessidade do processamento pós-PCR, como ocorre no PCR convencional, fator esse que evita contaminação e economiza recursos e tempo. Estas vantagens da técnica de PCR Real Time baseada em fluorescência revolucionaram completamente a abordagem da quantificação do DNA e RNA baseada em PCR. Os testes de PCR Real Time são fáceis de executar, apresentam sensibilidade e especificidade bastante elevadas, e fornecem escopo para automação. A PCR Real Time é também referida como RT-qPCR quando é inserido ciclo adicional de transcrição reversa, que leva à formação de uma molécula de DNA a partir de uma molécula de RNA. Isso é feito porque o RNA é menos estável em comparação ao DNA.
2. COMPOSIÇÃO: Instrumento = TaqMan → é uma sonda que fluoresce específica para a sequência de DNA, medindo apenas o DNA de interesse o R - Reporter = dá a fluorescência e o Q - Quencher = sequestrador/absorve a fluorescência / marca
3. ETAPAS: A sonda pode ser desenhada para o meio de um gene, na região específica de escolha . 1ª: Sonda se anela a cada ciclo, acontece junto com o anelamento do primer 2ª: (no fim do ciclo) A medida em que a sonda (R+Q) se desfaz , R se solta e emite uma luz, apontando a presença do gene específico 3ª: Cada vez que é sintetizada uma nova fita há um aumento da intensidade da emissão fluorescente. 4ª: sendo assim, um PC mede essa intensidade da luz em tempo real e um gráfico me mostra a quantidade de bases a cada ciclo
4. APLICAÇÕES: Para diagnósticos, são amplamente utilizados na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções virais e bacterianas, em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Este método não depende do isolamento ou crescimento do patógeno ou da detecção de uma resposta imune contra o agente. Em vez disso, o que é detectado nos ensaios são as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos. Alguns exemplos de sua aplicação consistem no diagnóstico de dengue, infecções respiratórias, ISTs, anteriormente chamada de DSTs, e meningites. É utilizada também no diagnóstico de doenças genéticas, identificando mutações e pré-disposição genética para determinadas doenças, como é o caso da trombose. Essa técnica molecular também é utilizada na oncologia para identificação do cromossomo Philadeplhia, uma alteração citogenética que está associada a algumas formas de leucemia.

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	Erstellt von Marina Batista Lima vor etwa 3 Jahre