16110691
Description
Mind Map by Anna Rivera, updated more than 1 year ago
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Created by Anna Rivera
about 6 years ago
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PRUEBAS GENÉTICAS
- Hibridación Genómica Comparativa
- Es un método de citogenética molecular para analizar las
variaciones en el número de copias (CNV) en relación con el
nivel de ploidía del ADN de una muestra en comparación con
una muestra de referencia, esto sin la necesidad de realizar
un cultivo celular. El objetivo de esta técnica es comparar de
manera rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico
derivado de dos organismos diferentes, que a menudo se
relacionan pues se sospecha que tienen diferencias ya sea en
la ganancia o pérdida de cromosomas completos o regiones
subcromosomales (una porción del cromosoma).
- En resumen, implica el aislamiento de ADN de las dos
fuentes a comparar, comúnmente la referencia y una
muestra, el etiquetado independiente de cada muestra de
ADN con diferentes fluoróforos (moléculas fluorescentes)
de distintos colores (generalmente rojo y verde), la
desnaturalización del ADN para volverlo monocatenario y
la hibridación de las dos muestras resultantes en una
proporción de 1:1 para una propagación normal de
cromosomas en metafase, a los cuales las muestras de
ADN marcadas se unirán en su locus de origen. A
continuación, las señales fluorescentes de colores se
comparan con el uso de un microscopio de fluorescencia y
un software.
- VENTAJAS: -Solo puede
detectar anormalidades
cromosómicas no
balanceadas. -Más rápida
que los métodos
tradicionales. -Presenta
mayor resolución.
- DESVENTAJAS: -Es costoso.
-Las aberraciones
cromosómicas que se
presentan deben ser
confirmadas por FISH.
-Nodetecta aberraciones
cromosómicas balanceadas.
- APLICACIONES: -Identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan
recurrentemente en los tumores. -Diagnóstico y pronóstico del cáncer. -Estudiar las
anormalidades cromosómicas en los genomas fetales y neonatales. -Diagnóstico de
anomalías complejas asociados con trastornos genéticos humanos. -Aberraciones
cromosómicas (Cri du Chat). -Aberraciones submicroscópicas (síndrome de
Prader-Willi). -Diagnóstico genético prenatal.
- VENTAJAS: -Solo puede
detectar anormalidades
cromosómicas no
balanceadas. -Más rápida
que los métodos
tradicionales. -Presenta
mayor resolución.
- En resumen, implica el aislamiento de ADN de las dos
fuentes a comparar, comúnmente la referencia y una
muestra, el etiquetado independiente de cada muestra de
ADN con diferentes fluoróforos (moléculas fluorescentes)
de distintos colores (generalmente rojo y verde), la
desnaturalización del ADN para volverlo monocatenario y
la hibridación de las dos muestras resultantes en una
proporción de 1:1 para una propagación normal de
cromosomas en metafase, a los cuales las muestras de
ADN marcadas se unirán en su locus de origen. A
continuación, las señales fluorescentes de colores se
comparan con el uso de un microscopio de fluorescencia y
un software.
- Es un método de citogenética molecular para analizar las
variaciones en el número de copias (CNV) en relación con el
nivel de ploidía del ADN de una muestra en comparación con
una muestra de referencia, esto sin la necesidad de realizar
un cultivo celular. El objetivo de esta técnica es comparar de
manera rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico
derivado de dos organismos diferentes, que a menudo se
relacionan pues se sospecha que tienen diferencias ya sea en
la ganancia o pérdida de cromosomas completos o regiones
subcromosomales (una porción del cromosoma).
- Secuenciación Exomica
- La secuenciación del exoma completo (WES) implica la
secuenciación de todas las regiones genómicas
codificantes, es decir, los exones. El objetivo de la
secuenciación del exoma completo (WES) es obtener la
máxima información genética posible de un paciente,
buscando las variantes genéticas a lo largo de los 20.000
genes que constituyen el exoma.
- El ADN es extraído de la muestra recibida. La preparación de la
biblioteca con una estrategia de enriquecimiento de secuencias
dianas avanzada que permite un flujo de trabajo optimizado y
reducir plazos de respuesta. La secuencia resultante está
perfectamente alineada con el genoma, y las variantes son
identificadas mediante un potente programa bioinformático. Las
variantes encontradas por NGS son analizadas para identificar
aquellas patológicas o potencialmente patológicas. La clasificación
de las variantes está de acuerdo con las recomendaciones de
ACMG. En CGC Genetics todas las potenciales mutaciones/
variantes detectadas por NGS son confirmadas mediante
secuenciación de Sanger. El uso de dos diferentes metodologías
para la detección de mutaciones potencialmente patológicas
permite la obtención de un diagnóstico clínico muy robusto,
eliminándose al mismo tiempo los posibles artefactos y falsos
positivos.
- VENTAJAS: -Máximo
rendimiento diagnóstico
actualmente disponible;
- APLICACIONES: -Ampliación del fenotipo clínico a
través de la identificación de nuevos genes con
significado clínico; -Detección de nuevas
variantes o genes asociados a la patología aún
no descritos; -Confirmación de posibles
variantes mediante secuenciación de Sanger;
-Resolver casos diagnósticos complejos;
-Informe con interpretación e integración clínica.
- VENTAJAS: -Máximo
rendimiento diagnóstico
actualmente disponible;
- El ADN es extraído de la muestra recibida. La preparación de la
biblioteca con una estrategia de enriquecimiento de secuencias
dianas avanzada que permite un flujo de trabajo optimizado y
reducir plazos de respuesta. La secuencia resultante está
perfectamente alineada con el genoma, y las variantes son
identificadas mediante un potente programa bioinformático. Las
variantes encontradas por NGS son analizadas para identificar
aquellas patológicas o potencialmente patológicas. La clasificación
de las variantes está de acuerdo con las recomendaciones de
ACMG. En CGC Genetics todas las potenciales mutaciones/
variantes detectadas por NGS son confirmadas mediante
secuenciación de Sanger. El uso de dos diferentes metodologías
para la detección de mutaciones potencialmente patológicas
permite la obtención de un diagnóstico clínico muy robusto,
eliminándose al mismo tiempo los posibles artefactos y falsos
positivos.
- La secuenciación del exoma completo (WES) implica la
secuenciación de todas las regiones genómicas
codificantes, es decir, los exones. El objetivo de la
secuenciación del exoma completo (WES) es obtener la
máxima información genética posible de un paciente,
buscando las variantes genéticas a lo largo de los 20.000
genes que constituyen el exoma.
- Amplificación de Sondas Dependientes de Ligandos Múltiples
- Es una técnica de biología molecular, (Multiplex PCR), que permite que
en una misma reacción se pueda detectar copias anormales de hasta
50 secuencias genómicas diferentes de ARN o ADN. La técnica de
MLPA se basa en una primera reacción de unión-ligación de sondas
con la zona homóloga de interés; sólo las sondas que hayan hibridado
podrán ser ligadas, y posteriormente amplificadas por PCR. Mediante
un análisis de fragmentos y aprovechando la diferencia de tamaño
de cada una de las sondas, se podrán identificar aberraciones en el
número de copias genómicas.
- -DESNATURACION DEL ADN Para deSnaturar la hebra de ADN; Se utiliza
calor a 98°C por 5 minutos Agrega la salsa y el tampón MLPA -.
HIBRIDACION Se incuba a 95°C por un minuto, adicionándole las 16 horas
de hibridación a 60°C - LIGADURA Agregue la mezcla de ligasa y se
incuba 15 minutos a 54°C. Agregue calor para inactivar la ligasa,
5minutos a 98°C. Agregar los cebadores, dNTPs y polimerasa. - PCR Inicio
de la PCR. - ELECTROFORESIS CAPILAR Determinar el tamaño relativo de
los picos fluorescentes
- VENTAJAS: -Detección
de número de copias de
secuencias de ADN
genómicos en una
simple reacción, basada
en PCR Requiere
únicamente 20 ng de
ADN humano (3.000
células/0,5 ml de fluido
amniótico).
- DESVENTAJAS: -Costoso.
- Costo -Necesidad de
instrumental especifico
- APLICACIONES: -Detección de mutaciones. -Análisis
de perfiles de metilación, la cuantificación relativa
de ARNm, la caracterización cromosómica de líneas
celulares y muestras de tejido. -La detección de
variaciones en el número de copias del genoma,. -La
detección de duplicaciones y deleciones en genes
relacionados con la predisposición al cáncer
humano. -Determinación de aneuploidias.
-Diagnóstico prenatal
- VENTAJAS: -Detección
de número de copias de
secuencias de ADN
genómicos en una
simple reacción, basada
en PCR Requiere
únicamente 20 ng de
ADN humano (3.000
células/0,5 ml de fluido
amniótico).
- -DESNATURACION DEL ADN Para deSnaturar la hebra de ADN; Se utiliza
calor a 98°C por 5 minutos Agrega la salsa y el tampón MLPA -.
HIBRIDACION Se incuba a 95°C por un minuto, adicionándole las 16 horas
de hibridación a 60°C - LIGADURA Agregue la mezcla de ligasa y se
incuba 15 minutos a 54°C. Agregue calor para inactivar la ligasa,
5minutos a 98°C. Agregar los cebadores, dNTPs y polimerasa. - PCR Inicio
de la PCR. - ELECTROFORESIS CAPILAR Determinar el tamaño relativo de
los picos fluorescentes
- Es una técnica de biología molecular, (Multiplex PCR), que permite que
en una misma reacción se pueda detectar copias anormales de hasta
50 secuencias genómicas diferentes de ARN o ADN. La técnica de
MLPA se basa en una primera reacción de unión-ligación de sondas
con la zona homóloga de interés; sólo las sondas que hayan hibridado
podrán ser ligadas, y posteriormente amplificadas por PCR. Mediante
un análisis de fragmentos y aprovechando la diferencia de tamaño
de cada una de las sondas, se podrán identificar aberraciones en el
número de copias genómicas.
- PCR
- Su objetivo es obtener un gran número de copias de un
fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría
basta partir de una única copia de ese fragmento original, o
molde. Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos
repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
- La desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para
separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona
los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. Templado
(5555 - 6565°C): la reacción se enfría para que los cebadores
puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de
ADN de cadena sencilla. Extensión (72°C): la temperatura de la
reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los
cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.
- VENTAJAS: -Alta sensibilidad.
-Alta especifidad. -Rápidez.
- DESVENTAJAS: -Puede
contaminarse con otro
ADN.
- APLICACIONES: -Investigación. -Diagnóstico de enfermedades
hereditarias. - Genotipar la especie o especies que provocan
un determinado cuadro infeccioso (virus). -Demostración de
oncogenes,.-Arqueología. -Medicina forense.
- VENTAJAS: -Alta sensibilidad.
-Alta especifidad. -Rápidez.
- La desnaturalización (96°C): la reacción se calienta bastante para
separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona
los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. Templado
(5555 - 6565°C): la reacción se enfría para que los cebadores
puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de
ADN de cadena sencilla. Extensión (72°C): la temperatura de la
reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los
cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.
- Su objetivo es obtener un gran número de copias de un
fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría
basta partir de una única copia de ese fragmento original, o
molde. Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos
repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
- Secuenciación de Transcriptoma
- Proporciona información fundamental sobre cómo se organizan y
regulan los genomas, lo que nos brinda información valiosa sobre
el estado interno de las células y cómo la expresión alterada de
las variantes genéticas contribuye a la investigación de
enfermedades complejas. La secuenciación de transcriptomas se
basa en la metodología y técnicas de secuenciación de próxima
generación.
- Partimos de un fragmento de ARN con una cola poli-A, o de su
cDNA complementario (cola poli-T). -Suelen ser secuencias grandes,
que se fragmentan en secuencias de 200-500 bps para
secuenciarlas -Los fragmentos se almacenan en una biblioteca de
Expressed Sequence Tags (ESTs), con adaptadores (para activar la
secuenciación) -Se realiza la secuenciación y las lecturas se alinean
con los ORFs conocidos: Lecturas exónicas, Lecturas de unión
interexónicas -Lecturas poli-A -Se cuentan las lecturas para cada
base " nivel de expresión.
- VENTAJAS: -Ofrece un
rango dinámico más
amplio, que permite una
medición más sensible y
precisa de los cambios en
la expresión génica
-Captura tanto las
características conocidas
como las novedosas.
-Puede aplicarse en una
amplia gama de especies..
- APLICACIONES:
-Identificar eventos de
splicing alternativos.
-Cambios en la expresión
génica. -Diagnóstica de
enfermedades
hereditarias. -Identifica
eventos de fusión génica
-Identifica “SNVs”
(variantes de un
nucleótido simple o SNPs).
- VENTAJAS: -Ofrece un
rango dinámico más
amplio, que permite una
medición más sensible y
precisa de los cambios en
la expresión génica
-Captura tanto las
características conocidas
como las novedosas.
-Puede aplicarse en una
amplia gama de especies..
- Partimos de un fragmento de ARN con una cola poli-A, o de su
cDNA complementario (cola poli-T). -Suelen ser secuencias grandes,
que se fragmentan en secuencias de 200-500 bps para
secuenciarlas -Los fragmentos se almacenan en una biblioteca de
Expressed Sequence Tags (ESTs), con adaptadores (para activar la
secuenciación) -Se realiza la secuenciación y las lecturas se alinean
con los ORFs conocidos: Lecturas exónicas, Lecturas de unión
interexónicas -Lecturas poli-A -Se cuentan las lecturas para cada
base " nivel de expresión.
- Proporciona información fundamental sobre cómo se organizan y
regulan los genomas, lo que nos brinda información valiosa sobre
el estado interno de las células y cómo la expresión alterada de
las variantes genéticas contribuye a la investigación de
enfermedades complejas. La secuenciación de transcriptomas se
basa en la metodología y técnicas de secuenciación de próxima
generación.
- Hibridación Fluorescente in Situ
- Es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la
cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y
permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así
como de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite la
rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones,
inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un
cromosoma (cartografía genética).
- El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA
para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade
entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado
fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a las regiones
específicas para las que han sido diseñadas. Después, se tiñen los núcleos
con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas
de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes denominados
fluoróforos (método directo) o no fluorescentes que se detectan con
anticuerpos fluorescentes (método indirecto). Por último, se visualiza la
muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.
- VENTAJAS: -La resolución es
buena (› ~ 2mb). -Puede ser
aplicada a células en células en
división como en no división. -La
técnica es confiable. -La
hibridación con múltiples sondas
permite la detección de
productos de translocación.
-Puede identificar un rango de
mutaciones. -Monitoreo periódico
o enfermedad residual en MO.
- DESVENTAJAS: -No puede
detectar pequeñas
mutaciones. -Omite
Uniparental disomías.
-Omite Inversiones.
-Sondas no están
comercialmente
disponibles para todos las
regiones cromosómicas.
- APLICACIONES: -Diagnóstico genético preimplantatoriodiagnóstico genético
preimplantatorio. -Detección de anomalías: aneuploidias, perdida de una
región cromosómica, un cromosoma entero o para monitorizar la
progresión de una aberración. -Diagnóstico de enfermedades genéticas.
-Investigación para: el mapeo de genes, identificación de nuevos oncogenes
que contribuyan a diversos tipos de cancer.
- VENTAJAS: -La resolución es
buena (› ~ 2mb). -Puede ser
aplicada a células en células en
división como en no división. -La
técnica es confiable. -La
hibridación con múltiples sondas
permite la detección de
productos de translocación.
-Puede identificar un rango de
mutaciones. -Monitoreo periódico
o enfermedad residual en MO.
- El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA
para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade
entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado
fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a las regiones
específicas para las que han sido diseñadas. Después, se tiñen los núcleos
con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas
de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes denominados
fluoróforos (método directo) o no fluorescentes que se detectan con
anticuerpos fluorescentes (método indirecto). Por último, se visualiza la
muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.
- Es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la
cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y
permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así
como de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite la
rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones,
inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un
cromosoma (cartografía genética).
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