Práctica 11 Inmunoensayo enzimático (ELISA)

Description

Práctica Inmunoensayo enzimático (ELISA)
Eduardo Molina
Mind Map by Eduardo Molina, updated more than 1 year ago
Eduardo Molina
Created by Eduardo Molina almost 4 years ago
584
0

Resource summary

Práctica 11 Inmunoensayo enzimático (ELISA)
  1. Objetivo general
    1. Conocer el fundamento teórico y los usos de la prueba de ELISA, mediante una prueba indirecta, para interpretar los resultados y aplicarlos en el diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas en medicina veterinaria.
    2. Objetivos particulares
      1. 1. Realizar la prueba de ELISA indirecta para el diagnóstico de micoplasmosis (Mycoplasma hyopneumoniae), mediante el empleo de sueros sanguíneos de cerdo para identificar reacciones positivas y negativas.
        1. 2. Identificar las modalidades de la prueba de ELISA mediante el análisis de los fundamentos de cada prueba para establecer sus aplicaciones en la práctica veterinaria.
        2. Importancia
          1. La técnica de ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima (conjugado), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al fijar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) sobre un soporte, la reacción antígeno- anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, al adicionar el conjugado y su sustrato específico, se producirá un color observable a simple vista y cuantificable espectrofotométricamente.
          2. ¿DE QUÉ CONSTA LA PRUEBA DE ELISA?
            1. Constan de los siguientes elementos: fase sólida, antígeno, anticuerpo, control positivo, control negativo, conjugado, enzima, sustrato y muestra.
              1. Es el analito que se puede fijar a la fase solida; puede ser el elemento conocido o provenir de la muestra a determinar (elemento
                1. Antígeno
                2. Fase sólida.
                  1. Es la placa de 96 pozos de fondo plano, donde las moléculas de Antígenos o Anticuerpos se unen con la superficie de la placa a través de las fuerzas electroestáticas. La placa puede ser de poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon o silicona. Los mejores resultados se obtienen con el poliestireno y el polivinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades de unión.
                  2. Anticuerpo.
                    1. Al igual que el antígeno, puede estar fijado en la placa (elemento conocido) o ser la muestra a probar (elemento desconocido). Los anticuerpos para la técnica de ELISA son monoclonales o policlonales.
                    2. Control positivo. Suero con un título de anticuerpos conocidos y específicos contra el antígeno. Control negativo. Suero sin anticuerpos contra el antígeno. Ambos controles aseguran que la prueba está funcionando correctamente.
                      1. Conjugado. Antígeno o anticuerpo unido a una enzima. Dicho conjugado debe mantener estables sus propiedades inmunológicas y enzimáticas.
                        1. Enzima. debe acoplarse fácilmente a antígenos o anticuerpos, ser estable tanto libre como conjugada, ser altamente reactiva, encontrarse en estado puro, disponible, a precio razonable y ser segura. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa.
                          1. Sustrato. Es una sustancia que modifica su estructura tras reaccionar con su enzima específica y produce un cambio que detectan los sistemas colorimétricos, fluorescentes y luminiscentes. La elección del sustrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura y estabilidad después de la reacción. Requerimientos del sustrato: solubles en agua, fácil de manipular, no tóxicos, no mutagénicos y de bajo costo. Los más utilizados son TMB (3-3´-5-´- tetrametilbenzidina), ABTS (sal diamino del ácido 2-2-azino-di-(3 etil - benzotiazolinsulfónico- 6), OPD (O-fenilendiamina) y tolidina
                            1. Muestra. Puede ser: saliva, suero, plasma, orina, heces, sangre, etcétera.
                            2. Clasificación de las pruebas de ELISA
                              1. ELISA indirecta
                                1. Esta modalidad se diseña para detectar los anticuerpos que el individuo ha creado contra el antígeno. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado con la enzima.
                                2. ELISA sándwich
                                  1. Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos. En esta modalidad se usan dos tipos de anticuerpo contra el antígeno específico, uno sin marcar y otro marcado, el primero se encuentra fijado a la placa y el segundo se añadirá después de haber agregado la muestra problema (antígeno).
                                  2. ELISA competitiva
                                    1. En esta modalidad, el anticuerpo de la muestra competirá con el conjugado (anticuerpo marcado) por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Para ello, se fija a la placa el antígeno, se agrega el suero problema y posteriormente se añade un conjugado contra el antígeno, se adiciona el sustrato sobre el que sea capaz Práctica 11  Inmunoensayo enzimático (elisa) 117 El contenido intelectual de este manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología de la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en trámite (agosto, 2018) de actuar la enzima marcadora. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra. La diferencia de densidad óptica es proporcional a la concentración del anticuerpo problema en la muestra.
                                  3. Usos de la prueba
                                    1. Enfermedades producidas por parásitos: babesias y tripanosomas, Toxocara canis, toxoplasmosis, triquinosis.
                                      1. Enfermedades producidas por micoplasmas.
                                        1. Enfermedades producidas por bacterias y sus productos: paratuberculosis, brucelosis, enterotoxinas, estreptococosis, salmonelosis.
                                          1. Enfermedades producidas por virus: Aujeszky, Newcastle, fiebre aftosa, leucemia felina, peste porcina africana, peste porcina clásica, rinotraqueitis infecciosa bovina, rotavirus y artritis viral equina.
                                            1. Determinación de hormonas, quimiocinas, citocinas u otros antígenos en muestras como saliva, orina, plasma, etcétera.
                                            2. HECHO POR: EDUARDO MOLINA
                                              Show full summary Hide full summary

                                              Similar

                                              Inmunidad innata
                                              Raymond Rivers
                                              Componentes de la sangre
                                              Titigz
                                              HIPERSENSIBILIDAD TIPO I
                                              Inmunología FacMed
                                              INFLAMACIÓN
                                              Valentina López
                                              Inmunología y Alergología - Mayo 2016/Mayo 2017
                                              Belén Vera Santana
                                              Características de la inmunidad innata y adaptativa
                                              Raquel Calzada
                                              INMUNOLOGIA
                                              Natalie Quintana
                                              HIPERSENSIBILIDAD TIPO III
                                              Inmunología FacMed
                                              ORGANOS LINFOIDES
                                              Aurora AG
                                              Tema 15. ENFERMEDADES AUTOINMUNES
                                              Claudia Llorca
                                              HIPERSENSIBILIDAD TIPO II
                                              Inmunología FacMed