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SECUENCIACIÓN
DEL ADN
- MAXAM &
GILBERT
- GENERALIDADES
- Es un método de secuenciación
que depende de la degradación
química específica del ADN que
describieron Maxam y Gilbert,
en 1977.
- La fragmentación específica del
ADN es la base de este método,
desarrollado en cinco pasos, que
a grandes rasgos implican el
marcaje radiactivo del extremo
5’ con 32P
- La modificación de una base, la
eliminación de la base modificada, rotura
de la cadena de ADN en la desoxirribosa
modificada y el análisis de la secuencia
fragmentada por electroforesis en gel de
poliacrilamida.
- La modificación de una base, la eliminación de
la base modificada, rotura de la cadena de
ADN en la desoxirribosa modificada y el
análisis de la secuencia fragmentada por
electroforesis en gel de poliacrilamida.
- La modificación de una base, la eliminación de
la base modificada, rotura de la cadena de
ADN en la desoxirribosa modificada y el
análisis de la secuencia fragmentada por
electroforesis en gel de poliacrilamida.
- La modificación de una base, la
eliminación de la base modificada, rotura
de la cadena de ADN en la desoxirribosa
modificada y el análisis de la secuencia
fragmentada por electroforesis en gel de
poliacrilamida.
- La fragmentación específica del
ADN es la base de este método,
desarrollado en cinco pasos, que
a grandes rasgos implican el
marcaje radiactivo del extremo
5’ con 32P
- Es un método de secuenciación
que depende de la degradación
química específica del ADN que
describieron Maxam y Gilbert,
en 1977.
- FUNDAMENTO
- Este método tiene la ventaja de que
puede emplear ADN de doble hebra, pero
requiere una separación de hebras o
fraccionamiento equivalente por cada
fragmento de restricción estudiado, lo
cual lo hace laborioso.
- Un fragmento de ADN se marca
radiactivamente en sus extremos con
gamma 32P ó gamma 32S dATP por
acción de la polinucleótido quinasa. La
técnica consiste en romper estas
moléculas marcadas con reacciones
químicas específicas para cada una de
las cuatro bases.
- El fragmento de ADN que se desea
secuenciar se desnaturaliza, se
marca el extremo 5' con
radiactividad, la muestra se divide
en cuatro alícuotas que son
tratadas con diferentes reactivos
químicos que cortan al ADN en
bases específicas (A, t, C, G).
- En cada alícuota, queda una
colección de fragmentos de
ADN de diferente tamaño
que termina en una base
específica.
- En cada alícuota, queda una
colección de fragmentos de
ADN de diferente tamaño
que termina en una base
específica.
- El fragmento de ADN que se desea
secuenciar se desnaturaliza, se
marca el extremo 5' con
radiactividad, la muestra se divide
en cuatro alícuotas que son
tratadas con diferentes reactivos
químicos que cortan al ADN en
bases específicas (A, t, C, G).
- Un fragmento de ADN se marca
radiactivamente en sus extremos con
gamma 32P ó gamma 32S dATP por
acción de la polinucleótido quinasa. La
técnica consiste en romper estas
moléculas marcadas con reacciones
químicas específicas para cada una de
las cuatro bases.
- Este método tiene la ventaja de que
puede emplear ADN de doble hebra, pero
requiere una separación de hebras o
fraccionamiento equivalente por cada
fragmento de restricción estudiado, lo
cual lo hace laborioso.
- APLICACIONES
- El método de Maxam y Gilbert es óptimo para
ADN que no puede secuenciarse de forma
adecuada mediante otros métodos (por ejemplo,
oligonucleótidos pequeños y secuencias de ADN
que producen terminación prematura debida a
estructuras secundarias fuertes).
- Puede usarse para mapear modifi
caciones de ADN, como
alquilaciones y roturas producidas
por carcinógenos, antineoplásicos
y otros agentes que tienen como
blanco el ADN.
- En ensayos de huella digital química
o enzimática, la técnica permite la
identificación precisa de
secuencias específi cas de ADN que
se unen a moléculas pequeñas y
proteínas.
- En ensayos de huella digital química
o enzimática, la técnica permite la
identificación precisa de
secuencias específi cas de ADN que
se unen a moléculas pequeñas y
proteínas.
- Puede usarse para mapear modifi
caciones de ADN, como
alquilaciones y roturas producidas
por carcinógenos, antineoplásicos
y otros agentes que tienen como
blanco el ADN.
- El método de Maxam y Gilbert es óptimo para
ADN que no puede secuenciarse de forma
adecuada mediante otros métodos (por ejemplo,
oligonucleótidos pequeños y secuencias de ADN
que producen terminación prematura debida a
estructuras secundarias fuertes).
- IMPORTANCIA
- La secuenciación química tiene ventajas
específicas. En primer lugar, los tratamientos
químicos son sencillos de controlar; el ataque
químico ideal, una base eliminada por hebra,
produce una buena distribución de materiales
marcados a través de la secuencia.
- En segundo lugar, cada base es atacada,
tal que en un corrimiento se desplegará
cada base individual. La distinción química
entre cada base es clara y la secuencia de
ambas hebras permite un chequeo más
adecuado.
- La distinción química entre cada
base es clara y la secuencia de
ambas hebras permite un chequeo
más adecuado. Estas reacciones
específi cas fueron elegidas para
proveer información más que sufi
ciente para la secuenciación.
- La distinción química entre cada
base es clara y la secuencia de
ambas hebras permite un chequeo
más adecuado. Estas reacciones
específi cas fueron elegidas para
proveer información más que sufi
ciente para la secuenciación.
- En segundo lugar, cada base es atacada,
tal que en un corrimiento se desplegará
cada base individual. La distinción química
entre cada base es clara y la secuencia de
ambas hebras permite un chequeo más
adecuado.
- La secuenciación química tiene ventajas
específicas. En primer lugar, los tratamientos
químicos son sencillos de controlar; el ataque
químico ideal, una base eliminada por hebra,
produce una buena distribución de materiales
marcados a través de la secuencia.
- GENERALIDADES
- SANGER
- GENERALIDADES
- Sanger también desarrolló otro método, el cual
emplea análogos de dNTP específicos de
terminación de cadena. Los análogos más
utilizados son los didesoxinucleótidos
trifosfatados (ddNTP), iguales que los dNTP pero
sin el grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la
desoxirribosa.
- Este método es más rápido y acertado
que el método químico de Maxam y
Gilbert, por lo que es el utilizado en la
actualidad de manera rutinaria en los
laboratorios.
- Este sistema separa las
cadenas de ADN de acuerdo
con su longitud; así, las más
pequeñas migrarán más rápido
y las más grandes, más lento.
- Este sistema separa las
cadenas de ADN de acuerdo
con su longitud; así, las más
pequeñas migrarán más rápido
y las más grandes, más lento.
- Este método es más rápido y acertado
que el método químico de Maxam y
Gilbert, por lo que es el utilizado en la
actualidad de manera rutinaria en los
laboratorios.
- Sanger también desarrolló otro método, el cual
emplea análogos de dNTP específicos de
terminación de cadena. Los análogos más
utilizados son los didesoxinucleótidos
trifosfatados (ddNTP), iguales que los dNTP pero
sin el grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la
desoxirribosa.
- FUNDAMENTO
- El principio del método “didesoxi” es el
siguiente: se aísla y se clona el ADN que
se desea secuenciar; este ADN se
desnaturaliza y se emplea una sola
hebra en la secuenciación.
- En la secuenciación se utiliza un iniciador o
primer marcado radiactivamente, el cual
usualmente es un fragmento de restricción, que
suministra el extremo 3’ OH que necesita la ADN
polimerasa para continuar la adición de
nucleótidos.
- El iniciador y el molde de ADN se alinean para
formar un complejo iniciador-molde y la mezcla
resultante se divide en cuatro partes. Con estas
mezclas se preparan cuatro tubos de reacción,
cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que
se desea secuenciar, la ADN polimerasa, el
iniciador marcado radiactivamente y los cuatro
dNTP.
- La reacción requiere la hebra molde de ADN de cadena sencilla marcada
radiactivamente, un iniciador, ADN polimerasa y cuatro dNTP. La
reacción es dividida en cuatro alícuotas, uno para cada base, cada tubo
contendrá uno solo de los ddNTP marcados y los otros tres dNTP y se
continúa con la polimerización incorporando los nucleótidos en sentido
5’ → 3’. Cuando se marcan con fl urocromos la reacción total se puede
hacer en un solo tubo, ya que el color emitido servirá para diferenciar las
cadenas.
- Para realizarlo se obtienen fragmentos de ADN de la
hebra molde de interés, se marcan los cuatro
nucleótidos con fluorocromo de distinto color, se
realiza el ciclo de secuenciación mediante PCR, se
eliminan NTP sobrantes.
- Los fragmentos son sometidos a electroforesis en
gel y mediante el sistema automatizado; el láser
emitirá la luz que el detector interpreta
diferencialmente de acuerdo con el fluorocromo
que pase por el haz de luz para generar un patrón
de curvas de acuerdo a la longitud de onda
diferente para cada base, a fin de poder leer la
secuencia obtenida.
- Los fragmentos son sometidos a electroforesis en
gel y mediante el sistema automatizado; el láser
emitirá la luz que el detector interpreta
diferencialmente de acuerdo con el fluorocromo
que pase por el haz de luz para generar un patrón
de curvas de acuerdo a la longitud de onda
diferente para cada base, a fin de poder leer la
secuencia obtenida.
- Para realizarlo se obtienen fragmentos de ADN de la
hebra molde de interés, se marcan los cuatro
nucleótidos con fluorocromo de distinto color, se
realiza el ciclo de secuenciación mediante PCR, se
eliminan NTP sobrantes.
- La reacción requiere la hebra molde de ADN de cadena sencilla marcada
radiactivamente, un iniciador, ADN polimerasa y cuatro dNTP. La
reacción es dividida en cuatro alícuotas, uno para cada base, cada tubo
contendrá uno solo de los ddNTP marcados y los otros tres dNTP y se
continúa con la polimerización incorporando los nucleótidos en sentido
5’ → 3’. Cuando se marcan con fl urocromos la reacción total se puede
hacer en un solo tubo, ya que el color emitido servirá para diferenciar las
cadenas.
- El iniciador y el molde de ADN se alinean para
formar un complejo iniciador-molde y la mezcla
resultante se divide en cuatro partes. Con estas
mezclas se preparan cuatro tubos de reacción,
cada uno con el ADN molde de hebra sencilla que
se desea secuenciar, la ADN polimerasa, el
iniciador marcado radiactivamente y los cuatro
dNTP.
- En la secuenciación se utiliza un iniciador o
primer marcado radiactivamente, el cual
usualmente es un fragmento de restricción, que
suministra el extremo 3’ OH que necesita la ADN
polimerasa para continuar la adición de
nucleótidos.
- El principio del método “didesoxi” es el
siguiente: se aísla y se clona el ADN que
se desea secuenciar; este ADN se
desnaturaliza y se emplea una sola
hebra en la secuenciación.
- APLICACIONES
- En general, secuencias de entre 15 a
200 nucleótidos desde el sitio del
iniciador pueden determinarse con
precisión mediante un solo iniciador e
inclusive es posible leer hasta 300
nucleótidos.
- El problema más grave es el apilamiento de bandas,
causado por las asas de apareamiento de bases que
se forman en el ADN en las condiciones de la
electroforesis del gel de acrilamida y que se
observan como un número de bandas en la misma
posición o inusualmente muy cercanas unas a otras
en la electroforesis.
- La secuenciación de Sanger arroja secuencias
de alta calidad para segmentos relativamente
largos de ADN (de hasta aproximadamente
900900900 pares de bases). La técnica suele
utilizarse para secuenciar fragmentos
individuales de ADN, como plásmidos
bacterianos o ADN copiado en la PCR.
- La secuenciación de Sanger arroja secuencias
de alta calidad para segmentos relativamente
largos de ADN (de hasta aproximadamente
900900900 pares de bases). La técnica suele
utilizarse para secuenciar fragmentos
individuales de ADN, como plásmidos
bacterianos o ADN copiado en la PCR.
- El problema más grave es el apilamiento de bandas,
causado por las asas de apareamiento de bases que
se forman en el ADN en las condiciones de la
electroforesis del gel de acrilamida y que se
observan como un número de bandas en la misma
posición o inusualmente muy cercanas unas a otras
en la electroforesis.
- En general, secuencias de entre 15 a
200 nucleótidos desde el sitio del
iniciador pueden determinarse con
precisión mediante un solo iniciador e
inclusive es posible leer hasta 300
nucleótidos.
- IMPORTANCIA
- Los procedimientos de secuenciación
automatizada están basados en el
método enzimático de Sanger, que suple
el marcaje radiactivo con métodos
quimioluminiscentes con el uso de
fluorocromos.
- Actualmente los genomas se secuencian con otros
métodos que son más rápidos y menos costosos, la
secuenciación de Sanger todavía se usa ampliamente
para secuenciar piezas individuales de ADN, como los
fragmentos utilizados en la clonación de ADN o los
generados a través de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
- La secuenciación de Sanger es costosa e ineficiente
para proyectos a gran escala, como la secuenciación de
un genoma completo o un metagenoma (el "genoma
colectivo" de una comunidad microbiana). Para tareas
como estas, las nuevas técnicas de secuenciación a
gran escala son más rápidas y menos costosas.
- La secuenciación de Sanger es costosa e ineficiente
para proyectos a gran escala, como la secuenciación de
un genoma completo o un metagenoma (el "genoma
colectivo" de una comunidad microbiana). Para tareas
como estas, las nuevas técnicas de secuenciación a
gran escala son más rápidas y menos costosas.
- Actualmente los genomas se secuencian con otros
métodos que son más rápidos y menos costosos, la
secuenciación de Sanger todavía se usa ampliamente
para secuenciar piezas individuales de ADN, como los
fragmentos utilizados en la clonación de ADN o los
generados a través de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
- Los procedimientos de secuenciación
automatizada están basados en el
método enzimático de Sanger, que suple
el marcaje radiactivo con métodos
quimioluminiscentes con el uso de
fluorocromos.
- GENERALIDADES
- TERMINADOR
FLUORESCENTE
- GENERALIDADES
- En estos sistemas automatizados el
fragmento de ADN fluorescente pasa
por el punto de tensión del
secuenciador automático, y estas
señales se envían a una computadora
con un programa especial.
- Para realizarlo se obtienen
fragmentos de ADN de la hebra
molde de interés, se marcan los
cuatro nucleótidos con fluorocromo
de distinto color, se realiza el ciclo
de secuenciación mediante PCR, se
eliminan NTP sobrantes.
- Los fragmentos son sometidos a electroforesis
en gel y mediante el sistema automatizado; el
láser emitirá la luz que el detector interpreta
diferencialmente de acuerdo con el
fluorocromo que pase por el haz de luz para
generar un patrón de curvas de acuerdo a la
longitud de onda diferente para cada base, a fin
de poder leer la secuencia obtenida.
- Los fragmentos son sometidos a electroforesis
en gel y mediante el sistema automatizado; el
láser emitirá la luz que el detector interpreta
diferencialmente de acuerdo con el
fluorocromo que pase por el haz de luz para
generar un patrón de curvas de acuerdo a la
longitud de onda diferente para cada base, a fin
de poder leer la secuencia obtenida.
- Para realizarlo se obtienen
fragmentos de ADN de la hebra
molde de interés, se marcan los
cuatro nucleótidos con fluorocromo
de distinto color, se realiza el ciclo
de secuenciación mediante PCR, se
eliminan NTP sobrantes.
- En estos sistemas automatizados el
fragmento de ADN fluorescente pasa
por el punto de tensión del
secuenciador automático, y estas
señales se envían a una computadora
con un programa especial.
- FUNDAMENTO
- Cuando el fluoróforo se
agrega en la terminación de
la cadena, se tiene la ventaja
de que este último método
puede llevarse a cabo en una
sola reacción en lugar de en
cuatro, como en el método
en que se marca el iniciador.
- En esta reacción los ddNTP
se marcan con fluorocromos
de diferente color para cada
base, con lo cual la
terminación de cada cadena
determinará el color y, por
ende, el NTP respectivo
- Esto hará que al fluorescer a
diferentes longitudes de onda, el
sistema óptico del equipo identifi
que directamente en un gráfi co
las señales de fluorescencia de
cada una de las bases
- Esto hará que al fluorescer a
diferentes longitudes de onda, el
sistema óptico del equipo identifi
que directamente en un gráfi co
las señales de fluorescencia de
cada una de las bases
- En esta reacción los ddNTP
se marcan con fluorocromos
de diferente color para cada
base, con lo cual la
terminación de cada cadena
determinará el color y, por
ende, el NTP respectivo
- Cuando el fluoróforo se
agrega en la terminación de
la cadena, se tiene la ventaja
de que este último método
puede llevarse a cabo en una
sola reacción en lugar de en
cuatro, como en el método
en que se marca el iniciador.
- APLICACIONES
- La secuenciación por
terminación fluorescente es
un método para el análisis de
la secuencia del ADN
mediante automatización
parcial.
- Es una variante modificada en
la cual el marcaje se realiza
con un fluoróforo unido de
forma covalente en el
oligonucleótido iniciador
utilizado.
- Es una variante modificada en
la cual el marcaje se realiza
con un fluoróforo unido de
forma covalente en el
oligonucleótido iniciador
utilizado.
- La secuenciación por
terminación fluorescente es
un método para el análisis de
la secuencia del ADN
mediante automatización
parcial.
- IMPORTANCIA
- Es una alternativa al método de Sanger.
Consiste en marcar el oligo cebador o los
terminadores con un compuesto fluorescente
y activar la reacción de secuencia. Los
productos de la reacción se detectan
directamente durante la electroforésis al
pasar por delante de un láser que al excitar
los fluoróforos permite detectar la
fluorescencia emitida.
- La mayor ventaja de este método
es que la secuenciación se puede
llevar a cabo en una sola reacción,
en lugar de en cuatro reacciones
como en el método del cebador
marcado.
- El método de secuenciado por terminador
fluorescente junto con analizadores de
secuencia de ADN de alto rendimiento se
utiliza ahora para la inmensa mayoría de los
proyectos de secuenciación, puesto que es
más fácil de llevar a cabo y tiene un coste
menor que los anteriores métodos de
secuenciación.
- El método de secuenciado por terminador
fluorescente junto con analizadores de
secuencia de ADN de alto rendimiento se
utiliza ahora para la inmensa mayoría de los
proyectos de secuenciación, puesto que es
más fácil de llevar a cabo y tiene un coste
menor que los anteriores métodos de
secuenciación.
- La mayor ventaja de este método
es que la secuenciación se puede
llevar a cabo en una sola reacción,
en lugar de en cuatro reacciones
como en el método del cebador
marcado.
- Es una alternativa al método de Sanger.
Consiste en marcar el oligo cebador o los
terminadores con un compuesto fluorescente
y activar la reacción de secuencia. Los
productos de la reacción se detectan
directamente durante la electroforésis al
pasar por delante de un láser que al excitar
los fluoróforos permite detectar la
fluorescencia emitida.
- GENERALIDADES
- HIBRIDACIÓN
- GENRALIDADES
- La hibridación es la construcción artificial
de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de
dos monocatenarios usando la
complementariedad de bases. Se trata, por
tanto, de un proceso de unión de dos
cadenas complementarias de ADN, ARN o de
ADN y ARN para formar una molécula de
ácido nucleico de doble cadena
- La hibridación puede llevarse a cabo en solución,
en soporte sólido o in situ. Las técnicas en soporte
sólido más usadas son el Southern blot, el
Northem blot y el dot blot. Las técnicas de
hibridación in situ también se utilizan bastante.
Existen diferentes tipos de soportes sólidos como
el papel de nitrocelulosa, las membranas de
nailon y los filtros Whatman No 541.
- La hibridación puede llevarse a cabo en solución,
en soporte sólido o in situ. Las técnicas en soporte
sólido más usadas son el Southern blot, el
Northem blot y el dot blot. Las técnicas de
hibridación in situ también se utilizan bastante.
Existen diferentes tipos de soportes sólidos como
el papel de nitrocelulosa, las membranas de
nailon y los filtros Whatman No 541.
- La hibridación es la construcción artificial
de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de
dos monocatenarios usando la
complementariedad de bases. Se trata, por
tanto, de un proceso de unión de dos
cadenas complementarias de ADN, ARN o de
ADN y ARN para formar una molécula de
ácido nucleico de doble cadena
- FUNDAMENTO
Y
APLICACIONES
- Blotting
- Southern blot
- El método tipo Southern o Southern blot fue
desarrollado por E. M. Southern para la
detección de genes específicos en el ADN
celular. El ADN es digerido con una enzima de
restricción y los fragmentos son separados por
tamaños mediante una electroforesis en un
gel.
- La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en
el filtro de una forma sencilla mediante
una exposición a una película de rayos
X para el caso de sondas radiactivas o
con una película sensible a la luz, para
el caso de sondas con fluorocromo.
- Tanto la técnica de Southern como
de Northern blot se usan poco hoy en
día al haber sido sustituidas por
técnicas derivadas de la PCR.
- Tanto la técnica de Southern como
de Northern blot se usan poco hoy en
día al haber sido sustituidas por
técnicas derivadas de la PCR.
- La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en
el filtro de una forma sencilla mediante
una exposición a una película de rayos
X para el caso de sondas radiactivas o
con una película sensible a la luz, para
el caso de sondas con fluorocromo.
- El método tipo Southern o Southern blot fue
desarrollado por E. M. Southern para la
detección de genes específicos en el ADN
celular. El ADN es digerido con una enzima de
restricción y los fragmentos son separados por
tamaños mediante una electroforesis en un
gel.
- Northern blot
- Es esencialmente idéntica al método de
Southern blot, salvo que las moléculas de ácido
nucleico de la muestra, en este caso de ARN
(total, mensajero, vírico, etc.), se separan por
electroforesis en condiciones desnaturalizantes
(en presencia de formaldehído, que forma
parte de la composición del gel).
- Esto es debido a que, a pesar de ser una
molécula de una sola cadena, se forman
complejas estructuras secundarias que
dificultan la migración. Al igual que en el
Southern blot, el ARN se transfiere a la
membrana de filtro y se hibridan con sondas
de ADN marcada. Durante la electroforesis se
pueden observan grandes cantidades de
ARNm correspondiente a ribosomal
- Esto es debido a que, a pesar de ser una
molécula de una sola cadena, se forman
complejas estructuras secundarias que
dificultan la migración. Al igual que en el
Southern blot, el ARN se transfiere a la
membrana de filtro y se hibridan con sondas
de ADN marcada. Durante la electroforesis se
pueden observan grandes cantidades de
ARNm correspondiente a ribosomal
- Es esencialmente idéntica al método de
Southern blot, salvo que las moléculas de ácido
nucleico de la muestra, en este caso de ARN
(total, mensajero, vírico, etc.), se separan por
electroforesis en condiciones desnaturalizantes
(en presencia de formaldehído, que forma
parte de la composición del gel).
- Southern blot
- CGH (hibridación
genómica comparada)
- La hibridación genómica comparada es una
técnica citogenética para detectar regiones
cromosómicas que están amplificadas o
delecionadas en una muestra,
especialmente en tumores.
- En la CGH, dos muestras de DNA
genómico (una tumoral y una normal) se
marcan con diferentes fluorocromos y
se hibridan simultáneamente sobre una
extensión de cromosomas metafásicos.
- La relación de intensidad entre las dos
señales fluorescentes proporciona una
medida de la relación entre el número de
copias de las dos muestras de DNA
genómico.
- La alta resolución de esta
técnica permite la detección de
desequilibrios genómicos
submicroscópicos
- La alta resolución de esta
técnica permite la detección de
desequilibrios genómicos
submicroscópicos
- La relación de intensidad entre las dos
señales fluorescentes proporciona una
medida de la relación entre el número de
copias de las dos muestras de DNA
genómico.
- En la CGH, dos muestras de DNA
genómico (una tumoral y una normal) se
marcan con diferentes fluorocromos y
se hibridan simultáneamente sobre una
extensión de cromosomas metafásicos.
- La hibridación genómica comparada es una
técnica citogenética para detectar regiones
cromosómicas que están amplificadas o
delecionadas en una muestra,
especialmente en tumores.
- Microarrays de ADN
- Los microarreglos constituyen una distribución
ordenada de más de 10 mil genes por cm2 en
una pequeña superfi cie, del tamaño de un
portaobjetos, en el cual pueden estudiarse
simultáneamente mediante hibridación y
puede obtenerse una interpretación
instantánea de la expresión de múltiples genes
(distinguibles unos de otros) en un solo análisis.
- El fundamento de la técnica de
microarreglos se basa en la hibridación
de ácidos nucleicos y su detección por
fluorescencia mediante análisis de
imagen, de tal manera que, como en
otras técnicas, sólo se obtendrá señal
fluorescente en los puntos (genes)
donde haya habido hibridación.
- La intensidad de fluorescencia
será directamente proporcional al
nivel de expresión del gen
- El tipo de ensayo de microarreglos dependerá de
la sonda utilizada. Entre los más comunes se
encuentran los empleados para determinar
cambios en los niveles de expresión de genes o
análisis de mutaciones o polimorfi smos. En el
caso de las sondas, los oligonucleótidos son ADN
sintético de cadena sencilla (15 a 25 o 50 a 120
nucleótidos)
- El tipo de ensayo de microarreglos dependerá de
la sonda utilizada. Entre los más comunes se
encuentran los empleados para determinar
cambios en los niveles de expresión de genes o
análisis de mutaciones o polimorfi smos. En el
caso de las sondas, los oligonucleótidos son ADN
sintético de cadena sencilla (15 a 25 o 50 a 120
nucleótidos)
- La intensidad de fluorescencia
será directamente proporcional al
nivel de expresión del gen
- El fundamento de la técnica de
microarreglos se basa en la hibridación
de ácidos nucleicos y su detección por
fluorescencia mediante análisis de
imagen, de tal manera que, como en
otras técnicas, sólo se obtendrá señal
fluorescente en los puntos (genes)
donde haya habido hibridación.
- Un microarreglo es una distribución ordenada de genes en una pequeña
superficie, y mediante hibridación con el ADN problema se puede obtener
respuesta instantánea de la actividad o expresión de múltiples genes en
un solo análisis. La intensidad de fl uorescencia es directamente
proporcional al nivel de expresión del gen. La interpretación de los
marcajes indicará un patrón de colores; así, cada punto en el soporte del
microarreglo se asocia con el gen localizado según su color.
- Los microarreglos constituyen una distribución
ordenada de más de 10 mil genes por cm2 en
una pequeña superfi cie, del tamaño de un
portaobjetos, en el cual pueden estudiarse
simultáneamente mediante hibridación y
puede obtenerse una interpretación
instantánea de la expresión de múltiples genes
(distinguibles unos de otros) en un solo análisis.
- Hibridación in situ
- Es una técnica de hibridación
que se realiza directamente
sobre tejido, células o
cromosomas localizados sobre
un soporte sólido,
habitualmente un portaobjetos.
- La visualización puede realizarse por
medios isotópicos , enzimáticos o con
fluorescencia , siendo evaluada en un
microscopio. Su gran virtud es que
permite identificar las células donde se
produce la hibridación que detecta la
alteración genómica o transcripcional.
- La visualización de resultados puede
realizarse por marcaje con fluorescencia de
la sonda (FISH) o cromogénico (CISH, SISH).
Este último tiene la ventaja de poder
realizarse en microscopio de campo claro y
poder almacenarse casi indefinidamente
las preparaciones
- Los usos más frecuentes en Patología
molecular son la detección de
amplificaciones (Ej. Her2 en cáncer de
mama c-myc en linfoma de Burkitt),
traslocaciones ( linfoma folicular,
linfoma del manto, sarcomas) y
presencia de virus (Epstein-Barr, HPV).
- Los usos más frecuentes en Patología
molecular son la detección de
amplificaciones (Ej. Her2 en cáncer de
mama c-myc en linfoma de Burkitt),
traslocaciones ( linfoma folicular,
linfoma del manto, sarcomas) y
presencia de virus (Epstein-Barr, HPV).
- La visualización de resultados puede
realizarse por marcaje con fluorescencia de
la sonda (FISH) o cromogénico (CISH, SISH).
Este último tiene la ventaja de poder
realizarse en microscopio de campo claro y
poder almacenarse casi indefinidamente
las preparaciones
- La visualización puede realizarse por
medios isotópicos , enzimáticos o con
fluorescencia , siendo evaluada en un
microscopio. Su gran virtud es que
permite identificar las células donde se
produce la hibridación que detecta la
alteración genómica o transcripcional.
- Es una técnica de hibridación
que se realiza directamente
sobre tejido, células o
cromosomas localizados sobre
un soporte sólido,
habitualmente un portaobjetos.
- Blotting
- IMPORTANCIA
- Es un método muy versátil que permite
estudiar el grado de relación genética
entre dos ácidos nucleicos. También
permite la detección de fragmentos de
DNA que son complementarios a
fragmentos monocatenarios de secuencia
conocida (sondas).
- Es un método muy versátil que permite
estudiar el grado de relación genética
entre dos ácidos nucleicos. También
permite la detección de fragmentos de
DNA que son complementarios a
fragmentos monocatenarios de secuencia
conocida (sondas).
- GENRALIDADES
- PIROSECUENCIACIÓN
- IMPORTANCIA
- Entre las ventajas de la pirosecuenciación, podemos
decir, que es un método rápido y en tiempo real. Por
otra parte, la secuenciación comienza con la
primera base a un lado del primer, de tal modo, que
el diseño del primer es más flexible. Otras ventajas,
refieren la rapidez en la preparación de la muestra y
los costos bajos de reactivos.
- La pirosecuenciación, es la primera alternativa
al método de Sanger convencional y se basa en
la detección de pirofosfato durante la síntesis
de ADN. Cuenta con ventajas de precisión,
flexibilidad, procesamiento en paralelo y fácil
automatización. Además, la técnica no tiene
necesidad de utilizar primers y nucleótidos
marcados, y de electroforesis en gel.
- La pirosecuenciación, es la primera alternativa
al método de Sanger convencional y se basa en
la detección de pirofosfato durante la síntesis
de ADN. Cuenta con ventajas de precisión,
flexibilidad, procesamiento en paralelo y fácil
automatización. Además, la técnica no tiene
necesidad de utilizar primers y nucleótidos
marcados, y de electroforesis en gel.
- Entre las ventajas de la pirosecuenciación, podemos
decir, que es un método rápido y en tiempo real. Por
otra parte, la secuenciación comienza con la
primera base a un lado del primer, de tal modo, que
el diseño del primer es más flexible. Otras ventajas,
refieren la rapidez en la preparación de la muestra y
los costos bajos de reactivos.
- APLICACIONES
- Es un sistema útil para analizar tanto
secuencias cortas de ADN como
polimorfismos de nucleótido simple
(SNP) y genotipificación. La longitud
de lectura tendrá que seguir
mejorando para dar aplicaciones más
precisas y más amplias a esta
alternativa.
- Las aplicaciones de la pirosecuenciación son
variadas, ya que dicho método se ha estado
utilizando en análisis de Polimorfismos de
Nucleótido Único (SNP), identificación de
bacterias y tipificación de hongos y virus. La
técnica, ha demostrado también, capacidad
para realizar secuenciación de librerías de
cDNA y de genomas completos.
- Las aplicaciones de la pirosecuenciación son
variadas, ya que dicho método se ha estado
utilizando en análisis de Polimorfismos de
Nucleótido Único (SNP), identificación de
bacterias y tipificación de hongos y virus. La
técnica, ha demostrado también, capacidad
para realizar secuenciación de librerías de
cDNA y de genomas completos.
- Es un sistema útil para analizar tanto
secuencias cortas de ADN como
polimorfismos de nucleótido simple
(SNP) y genotipificación. La longitud
de lectura tendrá que seguir
mejorando para dar aplicaciones más
precisas y más amplias a esta
alternativa.
- FUNDAMENTO
- El método consta de la unión de
hebras únicas de DNA a una esfera
(una hebra por esfera), por medio de
un adaptador, tras lo cual, son
sometidas a clonamiento in vitro.
Luego de que las esferas son
cargadas, ocurre la adición de las
enzimas DNA polimerasa, sulfurilasa,
ATP luciferasa y apirasa, y de los
sustratos APS y luciferin.
- Durante la preparación de la librería, el
ADN se fragmenta enzimáticamente por
sonicación; después se incorporan
adaptadores de doble cadena a los
extremos de los fragmentos de longitud
de 400-700 pb, mediante la acción de una
ADN ligasa.
- Cada uno de estos fragmentos tendrá un
adaptador complementario flanqueado
en la perla del andamiaje. El adaptador
localizado en el extremo opuesto servirá
de anclaje de la ADN polimerasa y de
inicio de la replicación.
- Cada uno de estos fragmentos tendrá un
adaptador complementario flanqueado
en la perla del andamiaje. El adaptador
localizado en el extremo opuesto servirá
de anclaje de la ADN polimerasa y de
inicio de la replicación.
- Durante la preparación de la librería, el
ADN se fragmenta enzimáticamente por
sonicación; después se incorporan
adaptadores de doble cadena a los
extremos de los fragmentos de longitud
de 400-700 pb, mediante la acción de una
ADN ligasa.
- El método consta de la unión de
hebras únicas de DNA a una esfera
(una hebra por esfera), por medio de
un adaptador, tras lo cual, son
sometidas a clonamiento in vitro.
Luego de que las esferas son
cargadas, ocurre la adición de las
enzimas DNA polimerasa, sulfurilasa,
ATP luciferasa y apirasa, y de los
sustratos APS y luciferin.
- GENERALIDADES
- La pirosecuenciación es un sistema
basado en el método enzimático, que
aprovecha la liberación de pirofosfato
cuando un nucleótido se incorpora en la
hebra de ADN en crecimiento, mediante
bioluminiscencia.
- Aprovecha el trifosfato que se
libera cuando el dNTP se une a la
cadena, en forma de pirofosfato
(PPi). Requiere de tres enzimas
adicionales: ATP-sulfurilasa,
luciferasa y apirasa
- Requiere de dos sustratos adicionales:
adenosin-fosfosulfato (APS) y
luciferina. Con estas enzimas vamos a
tener reacciones que de manera
natural generan señales luminosas,
ahorrándonos las marcas
fluorescentes, y haciendo el proceso
más rápido y barato
- Requiere de dos sustratos adicionales:
adenosin-fosfosulfato (APS) y
luciferina. Con estas enzimas vamos a
tener reacciones que de manera
natural generan señales luminosas,
ahorrándonos las marcas
fluorescentes, y haciendo el proceso
más rápido y barato
- Aprovecha el trifosfato que se
libera cuando el dNTP se une a la
cadena, en forma de pirofosfato
(PPi). Requiere de tres enzimas
adicionales: ATP-sulfurilasa,
luciferasa y apirasa
- La pirosecuenciación es un sistema
basado en el método enzimático, que
aprovecha la liberación de pirofosfato
cuando un nucleótido se incorpora en la
hebra de ADN en crecimiento, mediante
bioluminiscencia.
- IMPORTANCIA
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