Resumo: Aula 5 - Métodos bioquímicos para o estudo da célula

LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – CEDERJ - UENF SEGUNDO PERÍODO DISCIPLINA: Biologia Celular 1 Resumo: Aula 5 - Métodos bioquímicos para o estudo da célula Preparando a amostra · Para obter preparações de organelas isoladas e purificadas, é preciso romper as células. · São realizados diferentes procedimentos para adquirir uma amostra homogenia de acordo com tipo de célula que se quer estudar. · Exemplo 1: Amostra de exsudato peritoneal - A separação dos macrófagos de outras células que foram obtidas com a extração da amostra do exsudato peritoneal é realizada através de cultura primária explorando a atividade biológica natural dos macrófagos devido a sua adesão a substratos como vidro e plástico. · Exemplo 2: Separação de células do sangue - As hemácias e os leucócitos circulantes podem ser separados por diferença de densidade. Para agilizar o processo a amostra contido em um tubo de vidro é centrifugada. Assim, devida a densidade, as hemácias ficarão no fundo, sobre ela uma fina camada esbranquiçada contendo os leucócitos, e no sobredante o plasma sem células. · Precipitado é o material que se depositou no fundo do tubo que foi centrifugado e sobredante (pellet) é o material que não se depositou. · Exemplo 3: Separação de diferentes classes de linfócitos - A separação das diferentes classes de linfócitos é possível devido as diferenças das moléculas de sua membrana plasmática exposta ao meio extracelular que são incubadas com anticorpos fluorescentes. A separação é realizada por um aparelho chamado citômero de fluxo ou FACS que faz a leitura da fluorescência e intensidade de fluorescência das células. Este mesmo aparelho possui um sistema que coloca carga negativa nas gotas que contém uma célula fluorescente. Todas as gotas passarão por um campo elétrico que desviara as células com carga negativa para um recipiente, positiva para outro e gotas sem células para outro, separando finalmente os linfócitos. · Exemplo 4: Preparação homogênea de hepatócitos - O primeiro passo é realizar o rompimento das células unidas entre si e a matriz celular. Para isso é necessário retirar o cálcio utilizando quelantes como EDTA ou EGTA, além de quebrar as ligações proteicas usando enzimas proteolíticas como a tripsina. Depois de soltar as mesmas podem ser separadas por diferença de densidade por centrifugação obtendo uma preparação homogênea para iniciar o fracionamento. Rompimento celular · O objetivo do fracionamento celular é romper a membrana plasmática sem romper as membranas das organelas. Por ser um processo difícil existem diferentes métodos de rompimento para cada tipo celular. Dentre os mais usados estão: a. Choque osmótico: as células são colocadas e meio hiposmótico, aumentando de volume até arrebentar. É o método de escolha para romper hemácias por exemplo. b. Choque térmico: as células são congeladas e descongelas rapidamente, alternando-se, por exemplo, a imersão em nitrogênio líquido (-196ºC) e banho a 37ºC. c. Maceração: Pode ser realizada com homogeneizadores, parecidos a um liquidificador, ou com homogeneizadores de vidro, que se parecem com um copo onde entra justo um êmbolo, forçando as células s sofrer atrito entre os vidros. d. Sonicação: São utilizados aparelhos chamados sonicadores que emitem ultrassom e realizam o rompimento das células. e. Tratamento com detergente não iônico: Devido as moléculas do detergente não iônico serem anfipáticas, elas conseguem substituir as moléculas de fosfolípideos da membrana plasmática, causando o rompimento. Centrifugação diferencial · Através da centrifugação diferencial o conteúdo celular é separado em várias frações, explorando as diferenças de densidade entre os componentes celulares. Velocidade de centrifugação do homogeneizado e subsequente utilização do sobredante para novas centrifugações: · 1.000g,10min: células não rompidas e núcleos. · 10.000g, 10min: mitocôndrias, peroxisossomo, lisossomos e (clorolpastos). · 20.000g, 30min: membrana plasmática, retículo endoplasmático, complexo de Golgi e endossomos. · 2000.000g,várias horas: ribossomos, partícuals virais (se houver), macromoléculas como DNA e grandes complexos enzimáticos. · Somente com a centrifugação diferencial não é possível obter organelas totalmente isoladas das demais, devido por exemplo a baixa diferença de densidade entre lisossomos e peroxisossomo, além de nem todas as organelas do mesmo tipo possuírem a mesma densidade, ocorrendo pequenas variações. · Para contornar essa dificuldade, se utiliza em conjunto com a centrifugação, diferentes gradientes de densidades do meio em que as organelas são centrifugadas. · Neste tipo de centrifugação, o material que está a caminho do fundo do tubo encontra densidades cada vez maiores do líquido. Quando um componente da mistura de organelas encontra uma região do gradiente que tenha densidade igual à sua, entra em equilíbrio, formando uma "banda". · O sucesso do protocolo de fracionamento pode ser avaliado de duas maneiras: a. Por microscopia eletrônica: observando em cada etapa os componentes da célula presentes na respectiva fração e sua respectiva integridade. b. Pela dosagem de enzimas marcadoras em todas as frações: para uma enzima ser considerada marcadora de uma organela, é preciso que ela esteja presente apenas na respectiva organela e em nenhum outro luar da célula e que seja encontrada nessa organela em todos tipos celulares. Cromatografia de partição · A cromatografia por partição é adequada para separação de moléculas pequenas, como lipídeos e aminoácidos. Pode ser feita em papel ou numa fina camada de material inerte, como celulose ou sílica, aplicada sobre uma superfície de vidro. Cromatografias em coluna · Neste tipo usa-se uma coluna de vidro, plástico ou metal que foi preenchida com uma resina que exercerá um efeito de separação na amostra que a percorrer. · Os efeitos de separação numa cromatografia dependem da natureza da resina e podem ser de três tipos: 1. Filtração em gel: a resina é formada por esferas muito pequenas perfuradas por poros de tamanho definido. Conforme o líquido vai escoando, os componentes da amostra com diâmetro maior que os poros da resina passam direto e saem da coluna, ficando os menores presos, fazendo-se assim a separação por tamanho. 2. Troca iônica: A amostra percorre uma resina sem poros, mas que possui carga em sua superfície, ficando presa a mesma os componentes da amostra com carga contrária. 3. De afinidade: a resina é revestida com um ligante especifico para o componente que se deseja separar. (Tipo o esquema chave-fechadura). Este é o método mais eficaz para purificar a proteína que se deseja e geralmente é utilizado após terem sido realizadas as outras duas cromatografias para "limpar" a amostra. Eletroforese · É a técnica mais usada em Biologia Celular. Se baseia no estudo do comportamento de uma molécula num campo elétrico. · A eletroforese em condições desnaturantes e redutoras é uma técnica que separa proteínas de acordo com seu tamanho ou massa molecular. · Uma das aplicações da eletroforese (SDS-PAGE), pode ser procurar quantas proteínas fazem parte de uma amostra. · Com a técnica de eletro-transferência (Western blot) é possível testar se uma proteína que foi separada num gel é reconhecida por um anticorpo específico, seja produzido no laboratório ou mesmo no soro de um paciente.