Funcionamiento del sistema CRISPR/Cas – edición de genomas

Pimera etapa
1. Adquisición de secuencias espaciadoras tras la exposición al patógeno.
  1. Las secuencias se ubican en el citoplasma
  2. Célula reconoce a PAM
  3. Célula incorpora a PAM nucleótidos adyacentes como nueva secuencia espaciadora
    1. Genera copia de la secuencia repetida.
      1. Flanquea la espaciadora por ambos lados.
Segunda etapa.
1. Se transcribe el ARNcr
  1. CRISPR I
    1. Activa a Cas 3
  2. CRISPR II
    1. Activa a Cas 9
      1. Se requiere tracrARN
        Segundo ARN codificante
        Complementario a secuencia palindrómic a repetida
        Forma dímero con secuencias repetidas
        Al finalizar la transcripción.
      2. RNASA iii reconoce ARNcr/tracrARN.
        Lo procesa para generar transcrito maduro.
  3. CRISPR III
    1. Activa a Cas 6
Tercera etapa
1. Cas se asocia con ARNcr maduro
  1. Forma complejo CRISPR/Cas.
2. ARNcr guía al complejo hacia su blnco.
  1. Por medio de reconocimiento se secuencia complementaria.
3. En caso de segunda infección
  1. Secuencia espaciadora de ARNcr maduro reconoce y forma complejo ADN-ARN con el material exógeno.
    1. Reconocido por los dominios de Cas: RUVc y HNH.
      1. Cada uno corta una hebra distinta. (DSB)
        Puede ser reparado de dos maneras:
        Homóloga (HDR)
        Requiere introducción de secuencia con alto porcentaje de homología en 5' y 3'.
        No homóloga (NHEJ)
        Puede resultar en inserciones o deleciones no deseadas.
Utilidad en edición de genomas
1. Inserción de genes por recombinación homóloga
  1. CRISPR/Cas se dirige contra una secuencia específica
    1. Induce corte en ambas cadenas.
    2. Puede dirigirse a un locus e inducir HDR.
    3. Es capaz de trabaja en simultaneo con varios genes.
2. Delección dentro del genoma
  1. Gracias a actividad endonucleasa de Cas.
  2. Se emplea para generar deleciones de fragmentos grandes de ADN
  3. No hay correlación entre el tamaño y la frecuencia de deleciones.
3. Mutagénesis
  1. Detección y generación de mutaciones específicas.
  2. Mediante inserción de ARNg para varias secuencias específicas se induce mutagénesis.

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