Citometría de flujo.

Nota:

• - Anton Van Leeuwenhoek fue el primero en observar y describir una célula viva a través de microscopios con capacidad de hasta 250 aumentos. - Los seres vivos son organismos constituidos por diferentes tipos celulares, que trabajan para mantener una homeostasis. - Los microscopios nos permiten identificar a las células de acuerdo con su morfología. - Las células son idénticas, pero funcionalmente diferentes, como es el caso de los linfocitos. - Los linfocitos pueden registrarse en el microscopio óptico mediante tinción de Wright. - La citometría de flujo tiene relevancia y se encarga de resolver el problema. - La citometría de flujo es una técnica de análisis que permite identificar a poblaciones celulares simultáneamente. - La citometría de flujo permite obtener información, dependiendo de las proteínas que se expresen.

Nota:

• - La citometría es una tecnología que permite analizar características celulares a medida que son transportadas en un fluido e incididas por un haz de luz. - El citómetro de flujo mide el tamaño, la granularidad de la célula, y la fluorescencia de la misma. - Las características se determinan usando un sistema óptico acoplado a un procedimiento electrónico.

Nota:

• - Un citómetro se compone por tres principales sistemas, el de fluidos, el óptico, y el electrónico.

1. Sistema de fluidos

   Nota:

   • - Su función es alinear y transportar a las células dentro de una cámara de flujo hacia el haz de luz. - Es necesario que la muestra se encuentre suspendida en un fluido. - Se aplica una propiedad hidrodinámica. - La propiedad hidrodinámica consiste en la inyección de la muestra en el centro de una corriente de fluido envolvente. - La presión de la muestra es mayor que la presión del líquido envolvente. - Las células pueden ser alineadas en fila india, y se asegura que el haz de luz incida sobre una célula a la vez.   
2. Sistema óptico

   Nota:

   • - El sistema está compuesto por láseres y filtros. - Los láseres y filtros se encargan de iluminar a las células y dirigir las señales hacia los detectores apropiados. - Las células, al ser incididas por el láser, tendrán la capacidad de dispersar la luz de acuerdo a su tamaño y granularidad. - Si la luz se disperse frontalmente, se obtendrá un parámetro denominado FSC, que indica el tamaño de la célula. - Las células marcadas con fluorocromos serán excitadas por el láser. - La luz será dirigida hacia un detector, el cual recibirá la longitud de onda emitida por la excitación del fluorocromo. - El sistema óptico da a conocer el tamaño y la granularidad de la célula. - A medida que el citómetro posea más detectores, mayor será su capacidad para identificar poblaciones celulares.
3. Sistema electrónico

   Nota:

   • - Cuando la señal luminosa es generada, el haz de luz incide en la célula, por lo que debe traducirse en señales electrónicas. - El sistema consta de sensores luminosos como fotodiodos y fotomul tiplicadores. - Los sensores tienen la finalidad de convertir los fotones en electrones y éstos, a su vez, en corriente eléctrica. - La señal eléctrica es recibida por la computadora y traducida en gráficos e histogramas.

Nota:

• - La imagen representa la dispersión de la luz emitida una vez que el haz de luz incidió sobre la membrana celular.   - La desviación frontal de la luz determina el tamaño celular, mientras que la dispersión lateral de termina la complejidad.

Nota:

• - El marcaje celular con anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos, representa la identificación de subtipos celulares mediante el uso de la técnica de citometría de flujo. - Los anticuerpos monoclonales permiten detectar poblaciones específicas de células. - La tecnología consiste en la creación de un anticuerpo que sea capaz de unirse a una estructura específica. - El anticuerpo debe contener una unión covalente a un fluorocromo. - El fluorocromo emitirá luz fluorescente cuando sea excitado por el láser. - La célula se tiñe y facilitará la identificación de las células que se unieron al anticuerpo o marcador. - Los anticuerpos acoplados a fluorocromos, cuando son excitados, emiten fluorescencia a diferentes longitudes de onda. - Algunas moléculas emitirán luz verde, naranja, azul, roja o amarilla, dependiendo del fluorocromo seleccionado. - Dependiendo del modelo de citómetro de flujo que se utilice, será la cantidad de colores que se puedan leer simultáneamente.

1. Identificación de Leucocitos

   Nota:

   • - Identificación de leucocitos de sangre periférica de acuerdo con su tamaño y granularidad.  - Los linfocitos son células pequeñas y poco granulares por lo que se representan cerca del origen.  - Los monocitos con un tamaño y granularidad mayor y finalmente, los granulocitos, que son las células de mayor tamaño y complejidad.
   1. Grafico

Nota:

• - Los resultados pueden ser representados mediante una gráfica de puntos hasta una figura tridimensional. - la clave se centra en seleccionar los gráficos que reflejen los resultados con precisión y sin generar confusiones.

1. Gráfico de puntos

   Nota:

   • - Este gráfico muestra la relación entre dos marcadores diferentes y muestra a cada punto como un evento. - El desplazamiento de los puntos hacia la derecha indica la expresión de un marcador X. - El desplazamiento de los puntos hacia arriba, muestra la expresión de un marcador Y.
   1. Gráficos de puntos y de densidad

      Nota:

      • - La figura muestra las poblaciones de linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos, representadas en gráfico de puntos, pseudocolor, zebra y contornos.  
2. Gráficos de densidad

   Nota:

   • - Estos gráficos, representan las poblaciones con base en la expresión de dos marcadores. - Estos gráficos muestran la frecuencia relativa de las poblaciones. Ejemplo: - Las poblaciones con mayor número de eventos se representan mediante tonos de gris más intenso, mediante colores cercanos al naranja, o mediante líneas.
   1. Histogramas

      Nota:

      • - Los histogramas muestran la intensidad de expresión de un marcador versus el número de eventos. - El desplazamiento de la curva hacia la derecha indica mayor expresión del marcador. - El desplazamiento de la curva hacia la altura del pico indica la frecuencia de las células capturadas. - El área bajo la curva contiene a las células que se están analizando.
      1. Histograma

         Nota:

         • En el histograma se observan dos picos: - El pico de la derecha representa a las células positivas para el marcador de linfocitos T cooperadores CD4 - El pico de la izquierda muestra las células negativas para este marcador.
3. Gráficos 3D

   Nota:

   • - Los gráficos permiten comparar a las poblaciones con respecto a la expresión de tres marcadores diferentes y la frecuencia relativa. - Los histogramas pueden ser representados en gráficos de 3D, - Los histogramas permite la comparación de la expresión de dos marcadores diferentes versus el número de eventos.
   1. Gráficos Tridimensionales

      Nota:

      • - Histograma tridimensional que identifica las poblaciones de linfocitos T cooperadores y linfocitos T Citotóxicos, de acuerdo con la expresión de CD4 y CD8. - La altura de los picos indica el número de células registradas. - El histograma muestra a las poblaciones de linfocitos B, linfocitos T Cooperadores y linfocitos T Citotóxicos, de acuerdo con la expresión de CD3, CD4 y CD8.

Nota:

• - La citometría facilita el diagnóstico de patologías como leucemias, linfoma, inmunodeficiencia primaria. - La citometria facilita el monitoreo del estado hematológico de pacientes con infección de VIH, así como la detección de células cancerosas o tumorales. - La citometria analiza las funciones celulares como la proliferación, la fagocitosis y la apoptosis. - Existen diversas moléculas fluorescentes que se incorporan cuando las células realizan sus funciones. - Para determinar la proliferación celular, las células pueden ser teñidas por medio de una molécula fluorescente denominada éster de succinimidil-carboxifluo resceína, la cual se incorpora al interior de la célula, y ésta es diluida cuando la célula entra en proliferación. - La citometría permite identificar, caracterizar y separar poblaciones celulares. - Los equipos que pueden realizar este trabajo se denominan Cell Sorters. Ejemplo: - La nueva terapia aprobada por la FDA para tratar linfoma de linfocitos B, la cual consiste en el trasplante de linfocitos T con receptores de antígeno modificados. - El proceso implica purificar los linfocitos T del paciente y modificarlos genéticamente para expresar un receptor de superficie específico para un antígeno de cáncer. - Posteriormente, los linfocitos CAR-T se expanden y se reinfunden en el paciente como una inmunoterapia para atacar a células cancerosas. - la citometria puede conocer la cantidad de RNA o DNA que posee una célula, lo cual tiene una alta aplicación en el pronóstico de diversos tipos de cáncer. - La citometría sirve para el diagnóstico, clasificación y determinación del pronóstico de diversas enfermedades.