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| Question | Answer |
| Give the structure of an antibody | Gli anticorpi più comunemente utilizzati per lo sviluppo di metodi immunometrici sono le immunoglobuline G (IgG). La molecola, a forma di “Y”, è composta da due catene aminoacidiche leggere e due pesanti, unite da ponti disolfuro. La regione variabile Fab, che contiene gli N-terminali delle 4 catene, è responsabile del legame altamente specifico con l’antigene, quella costante Fc, che contiene i C-terminali, è specie specifica. |
| What's the Fab region? | la porzione Fab dell’anticorpo, con il sito di legame con l’antigene. Si può vedere come in questa porzione dell’anticorpo, perfettamente complementare all’antigene, siano presenti dei gruppi funzionali che stabiliscono numerose interazioni con l’antigene. (CDR) |
| Give 3 'digestions' of the IgG antibody | - digestion with pepsina -digestion with papaina -reduction with mercaptoetanolo |
| Give 4 interactions between antigen-antibody (non covalent) | - ponti idrogeno: Lo ioni idrogeno condiviso tra gruppi diversi crea parziali cariche opposte - legami ionici/forze elettrostatiche: attrazione tra cariche opposte -interazioni idrofobici: I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevol-mente con l’acqua e tendono a raggrupparsi insieme per escludere le molecole di acqua. L’attrazione coinvolge anche forze di Van der Waals -interazioni Van der Waals: Le fluttuazioni delle nuvole elettroniche attorno alle molecole generano polarità opposte su atomi vicini |
| What are tailored polymers? | I polimeri sartoriali rappresentano un tentativo di costruire in laboratorio una molecola con le caratteristiche di avidità e selettività degli anticorpi naturali, ma più stabili in condizioni non fisiologiche e disponibili in quantità illimitata |
| For what are tailored polymers used? | metodi immunometrici, fasi stazionarie per cromatografia di affinità ed estrazioni in fase solida, sensori, catalisi, ecc.. |
| How is a tailored polymer made? | - pre-polimerization: l’analita viene miscelato con uno o più monomeri funzionali (non)-covalent bounding La scelta dei monomeri è critica per l’ottenimento di un polimero in grado di legare con buona selettività ed affinità l’analita. -Polymerisation: with crosslinker; Il polimero viene poi triturato e setacciato per ottenere particelle del diametro desiderato. Infine l’analita viene rimosso. Nel polimero rimangono delle tasche, le quali, per dimensioni, forma ed orientamento di gruppi funzionali, sono in grado di alloggiare selettivamente l’analita. Anche la scelta del cross-linker e del solvente nel quale far avvenire la polimerizzazione è critica per l’ottenimento di un polimero con le caratteristiche morfologiche e meccaniche migliori. |
| Advantages of tailored polymers? | -Avidità e selettività di legame confrontabili con quelle degli anticorpi; - Elevata stabilità fisica (stress meccanici, temperature e pressioni elevate) e chimica (acidi, basi, solventi organici); -Disponibili in quantità illimitate e stabili per lunghi periodi di conservazione; -Possibilità di utilizzare le particelle per impaccare delle colonne per cromatografia di affinità. |
| What are the disadvantages of tailored polymers? | - poiché sono preparati in un solvente organico, il legame con l’analita è ottimale in ambiente organico, non in un fluido biologico; -è molto difficile stabilire a priori quali siano il monomero, il cross-linker, il solvente e le condizioni di polimerizzazione più adatti per un determinato analita; -il processo di triturazione e setacciatura per ottenere particelle di polimero nell’intervallo dimensionale desiderato è lungo e laborioso e comporta una grossa perdita di polimero (circa 50%); - la rimozione dell’analita dopo la poli-merizazione non è completa |
| What is molecular imprinting? | Molecular Imprinting is a process by which functional monomers are allowed to self-assemble around a template molecule and subsequently crosslinked into place. Under defined conditions the template molecule can be removed leaving behind a cavity complementary in shape and functionality, which will bind molecules identical to the template. |
| How is an antibody obtained? | Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). In questo caso viene chiamato antigene e funziona da immunogeno. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. Gli animali più utilizzati sono coniglio e capra per anticorpi policlonali, topo per anticorpi monoclonali |
| What are polyclonal antibodies? | Poiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi, mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. Questi anticorpi sono detti policlonali. Il protocollo di immunizzazione varia a seconda dell’antigene e dell’animale, ma in generale prevede due o più iniezioni di antigene, insieme ad un adiuvante (un agente che potenzia in modo non specifico la risposta immunitaria). |
| What are monoclonal antibodies? | L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali (monospecifici) |
| Proces of monoclonal antibodies? | 1) L’antigene viene iniettato nel topo e vengono prelevati dalla milza i linfociti B, i quali normalmente non crescono in coltura. 2) I linfociti B vengono messi a contatto con cellule di una linea cellulare di mieloma (cellule tumorali dell’organo linfatico), le quali si riproducono velocemente, sono resistenti e non producono anticorpi specifici. 3) In presenza di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole, una cellula tumorale si fonde con un linfocita dando origine a una nuova cellula detta ibridoma che cresce in vitro (caratteristica della cellula tumorale) e produce anticorpi monoclonali per l'antigene inizialmente iniettato nel topo (caratteristica del linfocita B). 4) Gli ibridomi vengono selezionati mediante coltura selettiva in presenza di amminoterina, che permette l’eliminazione dei linfociti e delle cellule tumorali che non si sono fuse. |
| How do we select the ibridomi? | gli ibridomi vengono coltivati in piastre per coltura cellulare. Per selezionare gli ibridomi che producono anticorpi specifici per l’antigene si fa adsorbire l’antigene nei pozzetti di una piastra per immunoassay ed a ciascun pozzetto si aggiunge il mezzo di coltura degli ibridomi, che contiene gli anticorpi secreti. Se il mezzo di coltura contiene un anticorpo specifico per l’antigene, si forma un complesso antigene-anticorpo riconoscibile mediante un anticorpo anti-immunoglobina marcato con un enzima. Si individuano così i pozzetti positivi, che però contengono numerosi ibridomi: occorre quindi isolare i singoli ibridomi di quel pozzetto. |
| How do we clone cells for obtaining a single antibody? | le cellule dei pozzetti positivi vengono diluite diverse volte con terreno di coltura, fino ad ottenere una singola cellula in ogni pozzetto di una piastra per coltura cellulare. Da quella cellula si origina poi una linea cellulare di cellule geneticamente identiche. Si testano nuovamente le linee cellulari, per identificare quelle positive. |
| How can we get a large amount of monoclonal antibodies? (techniques) | - il modo più diretto di produrli consiste nel far espandere gli ibridomi come tumori a singola cellula nella cavità peritoneale di un animale; con questa tecnica si producono 20-30 mg/ml di anticorpi; - in alternativa si possono produrre in vitro, ma la quantità è solo di 10 mg/ml; - una tecnica più innovativa è la produzione di anticorpi attraverso l’utilizzo di biofermentatori e bioreattori che permettono alle cellule di crescere ad alta densità secernendo grandi quantità di anticorpi (parecchi grammi alla settimana). |
| What are the advantages of monoclonal antibodies? (5) | - Caratteristiche (affinità e specificità) note e costanti - Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione - E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata - Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare - Solitamente caratterizzati da elevata specificità |
| What are the disadvantages of monoclonal antibodies? (5) | - Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene) - Tecniche di produzione più sofisticate - Non sempre reagiscono con la proteina A - Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene -Spesso caratterizzati da bassa affinità |
| What is a haptene? | Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”, che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene. |
| How is a haptene build? | anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore o anche il carrier |
| two ways to synthesise antibodies on the base of immunogen | - Anticorpo specifico per l’analita: with specific functional group - Anticorpo specifico per la classe without special group; for example a whole group of aromatic polycycles can be bounded |
| How can we produce an antiody specifically for 17 beta estradiolo | Per la produzione di un anticorpo specifico per il 17β-estradiolo, occorre produrre un immunogeno che lasci esposti i gruppi funzionali che differenziano il 17β-estradiolo dagli altri ormoni steroidei (estrone (no OH) e estriolo (2 OH) en met elk nog een OH op linkeruiteinde) La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno. |
| How can you produce antibodies for the identification of metal ions? | Me + EDTA: Si produce un anticorpo contro un chelato dello ione metallico, legato ad una proteina: per esempio Me-EDTA-BSA L’anticorpo non riconosce il metallo ma l’intero complesso Me-EDTA Me +GSH; Si produce un anticorpo contro un complesso Me-Proteina o Me-Molecola organica: Glutatione (GSH): i suoi gruppi tiolici liberi legano fortemente il Hg(II). L’anticorpo riconosce il complesso Me-GSH |
| Write the equilibrium reaction between Analyte and antibody | Ab + An -->(ka) An-Ab Ab + An <-- (kd) An-Ab with equilibrium constant: Keq = ka/kd = [An-Ab]/[Ab][An] dove An-Ab è il complesso analita-anticorpo, ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo ed è una misura dell’affinità dell’anticorpo per l’analita, cioè della forza del legame An-Ab. L’unità di misura per Keq è L mol-1. Anticorpi con Keq bigger than 10^8-10^9 L. mol-1 sono adatti per lo sviluppo di metodi immunometrici. |
| How can the affinity of an antibody for an analyte be measured? | with Scatchard plot Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo) [An-Ab]eq/[An]eq = Keq*Abt - Keq*[An-Ab]eq Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse y è KeqAbt e l’intercetta sull’asse x è Abt. (voor polyclonale antilichamen is het een curve waarbij elke associatie een eigen Keq heeft monoclonaal daarentegen is gewoon een rechte |
| What do the two lines (1&2) say about the antibody? | eterogeneità (differenza tra le due Keq); --> de twee rico's specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto). |
| What do the red and blue line stand for? | Keq massima (1) ed alla Keq minima (2) La retta 1 viene estrapolata per [An-Ab]eq che tende a zero. La retta 2 viene estrapolata per [An-Ab]/[An]eq che tende a |
| It's difficult to measure the An-Ab complex on the base of physical properties; how can we resolve this problem | with a marker: E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità. |
| What properties must the tracciante have in order to be good? | Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, quindi di fare avvenire la competizione in presenza di poche molecole, abbassando il limite di rivelazione del metodo. |
| What kind of markers are there?(5) | 1) un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA) 2) un enzima (enzyme immunoassay, EIA) 3) un substrato enzimatico 4) un coenzima o un inibitore enzimatico 5) una molecola fluorescente o un quencher |
| The detectionlimit for markers | Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa (10^-12 - 10-^20 g) e facilmente rivelabile |
| Why is it more advantagous to use an enzyme as a marker? | L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. |
| Why is it possible to use an enzyme as a marker? | E’ lecito chiedersi se un piccolo aptene (0,3-1 kDa) chimicamente legato ad un enzima (40-100 kDa), non sia impedito nel legame all’anticorpo a causa di un forte ingombro sterico. Tuttavia, visto che l’anticorpo è stato prodotto utilizzando come immunogeno l’aptene coniugato con una proteina carrier (60-100 kDa), è molto probabile che gli anticorpi riescano a legare l’aptene anche nella molecola di tracciante. La sintesi dell’immunogeno viene eseguita in modo da ottenere un elevato rapporto di coniugazione aptene/proteina e quindi esporre numerose molecole di aptene sulla superficie dell’immunogeno; la sintesi del tracciante enzimatico viene condotta in modo da ottenere un basso rapporto di coniugazione aptene/proteina e quindi un elevato rapporto segnale/massa, che produce un limite di rivelazione del metodo più basso. |
| What properties does the enzyme need to have for EIA (enzyme immunoassay) | - sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione - sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA. Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente si esprime in unità per mg (U/mg). |
| What are the advantages of using an enzyme as marker? | 1) sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; 2) sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; 3) una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; 4) è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. |
| What are the disadvantages of using an enzyme? | 1) l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; 2) la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; 3) si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione |
| Why are the enzymes added in excess of substrate? | Si può scegliere di misurare la velocità di scomparsa del substrato o quella di comparsa del prodotto. Il secondo metodo è preferibile poiché la misura è più accurata (ad es. da 0 a 1% per la comparsa del prodotto, da 100% a 99% per la scomparsa del substrato), soprattutto considerando che occorre lavorare in condizioni di eccesso di substrato. + for quicker reaction |
| What are two conditions in order to have the product of the reaction proportional to the enzyme? | - l’andamento della reazione è lineare nel tempo - l’attività enzimatica è proporzionale alla quantità assoluta di enzima. |
| in a longer timeframe (10-20 min) it's not proportional to the amount of the enzyme | |
| Give the michaelis menten reaction | |
| Give the substrates for the enzyme perossidasi and give the analytical methods (2) | - H2O2/cromogeno --> fotometria -H2O2/luminolo --> luminescenza |
| ive the substrates for the enzyme fosfatasi alcalina and give the analytical methods (2) (3) | - 4-nitrofenilfosfato --> fotometria - 4-metilumbelliferone-fosfato --> fluorimetria - AMPPD --> luminescenza |
| Give the substrates for the enzyme beta- galattosidasi and give the analytical methods (2) (3) | - 2-nitrofenolo --> fotometria - 4-metilumbelliferone --> fluorimetria - 2-naphthyl-beta-D-galactopyranoside --> luminescenza |
| Give the equation of lambert beer fotometria | T = i/i0 met i0 invallende straal en i uitgaande straal A = log(1T) = e*b*c met e: absorptiecoeff b: breedte cuvet c: concentratie |
| What is the concept of fotometria? | L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile. |
| What is the concept of fluorescence | L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate, successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni. |
| Give the equation for the fluoresence | |
| Draw a graph for fluoresence | |
| What is the concept of chemiluminesence? | |
| Give the equation for chemiluminesence | |
| Give the reaction of the oxidation of lumuniolo (3-aminoftalidrazide) | Ossidazione del luminolo (3-aminoftalidrazide) in ambiente alcalino mediante perossido d’idrogeno o altri agenti ossidanti, quali i perossidi organici. L'utilizzo di "enhancer" quali il p-iodofenolo ha permesso di aumentare l’intensità del segnale di alcuni ordini di grandezza e di ottenere una cinetica di emissione più lenta e stabile nel tempo. |
| Which enzymes can catalyze the reaction of the oxidation of luminolo? | - la perossidasi, - la microperossidasi - le catalasi, nonché da altre sostanze quali emoglobina, citocromo c, ione Fe3+ e vari complessi di metalli di transizione. Il prodotto di ossidazione del luminolo é l'anione amminoftalato nello stato eccitato, che é responsabile dell’emissione (max = 420 nm). |
| Give two functions of luminolo | - measure the activity of the marker enzyme perossidasi in excess of substrate - used as a marker; derivates: isoluminolo-antigene/isoluminolo-anticorpo Mostly the second one - amplification of the signal - emission kinetics characterised by a stationary state |
| What does AMPPD stand for? and whcih enzyme catalyses the decomposition? | AdaMantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato enzyme: fosfatasi alcalina (AP) |
| Give the reaction of AMPPD with the presence of the enzyme | |
| In which 4 categories can we classify the immunologic methods? | - competitive - non-competitive - heterogeneous - homogeneous |
| What's the difference between heterogeneous and homogeneous? | Eterogenei (su fase solida) Il metodo di rivelazione non permette di distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero. Questi metodi necessitano di una separazione della frazione libera da quella legata prima della misura, quindi prevedono l’immobilizzazione di un componente (antigene o anticorpo) su una fase solida; in alternativa si può procedere mediante precipitazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando glicole polietilenico o un secondo anticorpo in eccesso. Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida. |
| What's the difference between competitive and non-competitive systems? | |
| Give 5 ways to immobilze antibodies on a solid phase | 1) chimically 2) physically (adsorption) 3) biotin-avidina 4) proteine A 5) another antibody: anti - antibody haha complementair aan het echte antilichaam |
| Give the determining factors of physical absorption on a solid phase (5) | |
| Give two different ways to capture antibodies on a solid phase | |
| What is the concept of competitive methods? | |
| Give the proces of direct ELISA (heterogeneous competitive) | |
| Give the proces of indirect ELIS (heterogeneous competitive) | |
| How is the graph for competitive methods? | |
| How do you get the second curve? | |
| Discuss this graph: limite di recelazione, sensibilità, midrange, intervallo dinamico | |
| Give the equation for the logit log equation | |
| What does R stands for as a parameter to obtain a better graph for competitive methods? | Si indica con: Abt = concentrazione totale di anticorpo = [Ab]eq + [An-Ab]eq T = concentrazione totale di analita = [An]eq + [An-Ab]eq ovvero = [An]i + [An*]i (dove An è l’analita nel campione e An* è l’analita marcato) R = [An-Ab]eq/T, cioè frazione di analita legato. Questa è la variabile che viene di solito determinata nei metodi immunometrici |
| Rewrite the eq equation form with R | |
| Describe the following graph: | Una riduzione di Abt sposta la curva a concentrazioni di analita più basse, ma a scapito della sensibilità (confronto tra curve verde e blu). Un aumento di K aumenta la sensibilità (confronto tra curve blu e rossa). |
| What's the effect of the concentration of An* marker | |
| dia 84?? | |
| What does CR% stands for? and how an we measure it? | reattività crociata; legare gli interferenti CR% = a/b*100 a= concentrazione di analita che spiazza il 50 % di tracciante dall'anticorpo b= concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto |
| To develop a competitive method for a hapten there must be a coherence between the hapten and two other things; what are those two things | - to a carrier protein for the immunogen production - to an enzyme for the production of the tracer --> necessary to synthesize a derivative of the hapten so that: - introduce a reactive group in a hapten capable of reacting with the proteins - introduce the reactive group on the hapten to the end of a spacer arm (braccio spaziatore), so that the hapten is then inserted at a certain distance from the surface of the protein and can be freely recognized and bound by the antibody |
| How are the immunogen and tracciante synthesized for homogeneous or heterogeneous systems? | - Nei sistemi omologhi lo stesso derivato dell’aptene viene utilizzato per la sintesi dell’immunogeno e del tracciante. - Nei sistemi eterologhi immunogeno e tracciante sono sintetizzati utilizzando: --> due apteni simili ma non identici, con lo stesso ponte inserito nella stessa posizione (eterologia di aptene); --> lo stesso aptene, ma con un diverso ponte che unisce l’aptene alla proteina (eterologia di ponte); --> lo stesso aptene e lo stesso ponte, ma inserito in una posizione differente dell’aptene (eterologia di posizione). I sistemi eterologhi permettono di ottenere anticorpi con affinità maggiore per l’analita rispetto al tracciante, quindi di migliorare il limite di rivelazione del metodo. |
| What is the concept of EMIT? | EMIT = Enzyme-multiplied Immunoassay Technique Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo. |
| There are two systems for EMIT give the first one | |
| There are two systems for EMIT give the second one | |
| What's the concept of ECIA (homogeneous competitive) | ECIA= Enzyme Channeling Immuno Assay |
| What does FP stand for? (homogeneous competitive) | FP = Fluorescenza polarizzata |
| Give the graph of non-competitive methods | |
| Give the proces of Sandwich ELIS (non competitive heterogeneous) | |
| Which methods can be used for the revelation of an antibody? | |
| Give a non-competitive homogeneous method | |
| Give the curva-dose rispostra of non-competitive methods | |
| Discuss the second graph: imite di rivelazione, sensibilità, intervallo dinamico | |
| How can we reduce the detection limit? | - Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo (l’antigene viene catturato più efficacemente dell’anticorpo) - Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa) ottimizzando le condizioni di rivelazione, utilizzando principi di rivelazione maggiormente sensibili o sistemi di rivelazione amplificati. |
| What is the modulation of activity for competitive methods? (MA) | superior intrinsic specificity |
| What is the amplification of activity? (AA) | - lower detectionlimit - the use of monoclonal antibodies improve the specificity - it's quicker, particulary for low concentrations of analyte |
| What are the differences between homogeneous and heterogeneous methods? | |
| What are the most common cuses of interference with interferents? | - the presence of molecules in the sample that give a cross reaction with the antibody or they interfere with the formation of the complex or compete with the bounding of antigen-antibody - the presence of endogeneous enzyme (EIA) or colored/fluorescent molecules (spectophotometry/fluorescence) this can be avoided by a heterogeneous method because there is a wash phase before the measure |
| Explain the method for analysis of Cadmium (II) in water | * competitive method with monoclonal antibodies A. pre-analytic phase: 1) dilution of the sample with water 1/10 - 1/100 v/v with buffer 2) add an excess of EDTA |
| Give the determination of Hg(II) EPA official method | non-competitive method |
| Give the production of monoclonal antibodies | |
| What is the production of a stable antibody secreting hybrid |
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