CLAE.

CLAE.

Eluente / Fase móvel
1. Limpar a coluna com o menos polar para o mais polar
2. Pureza: UV - HPLC
3. Cuidado com o tamanho das particulas, devem ser 1/8 menor que a fase estacionária.
4. Em alguns casos recomenda-se filtrar e desgaseificar a fase móvel
  1. Membranas : - Ésteres de celulose, Teflon e Nylon
  2. A desgaseificação remove gases que podem interferir a linha de base, reprodutividade do fluxo, transparência na faixa de baixa UV, etc
Amostra
1. Preparação :
  1. - Fazer um clean up da amostra. - Usar uma solução diluida. -Dissolver a amostra na fase móvel.
  2. Sempre que possível dissolver a amostra na fase móvel ou em solventes mais fracos.
    1. FM: 30%:70% MeOH: Água; FE: C18
Bomba
1. - Velocidade de fluxo 0,5 a 3mL/min. - Pressões de ate 3500 psi. - Usar rampa de ate 1 minuto para iniciar ou desligar a bomba.
  1. Fluxos muito altos podem resultar em : destruição do suporte do recheio, pressão de trabalho alta e choques de pressão que degradam o leito da coluna e desgastam os selos da bomba e do injetor
2. Bombeamento Isocrático - Mesma composição da FM
3. Bombeamento Gradiente : Mudança na composição da FM
4. Pressão
  1. Pressões muito altas podem ser causadas por coluna suja, bloqueios, solvente muito viscoso ou fluxo elevado. A pressão variável por mal funcionamento da bomba ou bloqueios parciais no sistema.
  2. Pressões muito baixas podem ser causadas por vazamentos, mal funcionamento da bomba, fluxo baixo, etc.
Colunas
1. São de tubos de aço inoxidável de 5 a 25 cm, com recheio de partícula de 3 a 10 um
2. Quanto menor o tamanho da partícula, maior a separação e a pressão.
3. Limpeza da coluna de fase normal ocorre muitas vezes pela passagem do solvente de menor polaridade para o de maior polaridade. No caso de colunas de fase reversa utilizar somente tampões ou sais e Tetraidrofurano.
Definição : Técnica de separação usada para separar e quantificar componentes numa mistura líquida em altas pressões com o auxilio de duas fases, uma estacionaria (polar) e móvel (apolar).
Fase estacionária
1. Paríiculas devem ter tamanho regular para que não haja caminhos preferenciais e assim prejudique a separação e a resposta analítica.
2. Fase normal : FM apolar e FE polar Fase reversa: FM polar e FE apolar
Detectores
1. 1.Espectrofotométrico UV-Visível
  1. Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
  2. Normalmente usam lâmpadas típicas UV -VIS, deutério (UV) ou tungstênio (VIS), tendo comprimento de onda padrão 254 nm.
  3. Vantagens
    1. Apresenta alta absorbância para vários componentes devido à escolha de comprimento de onda e, consequentemente, tem maior sensibilidade.
    2. Permite maior seletividade, desde que um determinado comprimento de onda pode ser escolhido, onde o soluto de interesse absorve bastante e outros não.
    3. Promover a eficiência em eluição por gradiente através da habilidade de selecionar um comprimento de onda onde os componentes da fase móvel não apresentam uma variação de absorbância para diferentes concentrações.
    4. Permitir obter o espectro de absorbância de cada componente em separado após parar a vazão da fase móvel.
  4. Detectores : Fotométricos – comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm Espectrofotométricos – comprimento de onda variável: 190nm a 800nm Rede de Diodos - comprimento de onda variável: 256nm a 1024nm
2. 2.Índice de refração
  1. Para solutos que não absorvem no UV ou visível e, consequentemente, não são detectados por detectores fotométricos, a melhor escolha é o detector por índice de refração.
  2. Desvantagens
    1. Baixa sensibilidade
    2. Não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a composição da fase móvel)
    3. Temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura) APLICAÇÃO
3. 3.Fluorescência
  1. A fase móvel empregada nos detectores de fluorescência deve ser cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emissão depende do meio em que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicações, tais como análise quantitativa e eluição por gradiente, nas quais deve-se selecionar os componentes da fase móvel para não atrapalhar a fluorescência.
  2. A espectroscopia de fluorescência é um método de detecção dos mais sensíveis da atualidade, específico para compostos que fluorescem.
4. 4.Eletroquímico
  1. Métodos eletroquímicos de detecção oferecem a mais promissora solução para o problema de desenvolvimento de um detector para CLAE suficientemente sensível e não baseado em absorbância de luz.
  2. Eles oferecem vantagens de alta seletividade, alta sensibilidade e serem muito bons para as análises de traços. É importante destacar que, neste tipo de detecção, a amostra tem que ser constituída de íons ou compostos que sofram ou oxidação ou redução (detectores polarográficos).
  3. Os detectores eletroquímicos são bons para as modalidades de cromatografia que usam fases móveis aquosas, tais como a cromatografia por troca iônica, por exclusão ou com fase reversa por pares de íons ou até com fase reversa com compostos oxidáveis na fase água-álcool.
  4. Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico. A corrente gerada é proporcional a concentração do composto.
5. 5.Espectrométrico de massa (LC/MS)
  1. Os espectrômetros de massas são um tipo de detector para CLAE que pode combinar sensibilidade, versatilidade e universalidade e seu potencial de utilização é muito grande.
6. Características:
  1. Alta Sensibilidade e baixo limite de detecção. Estabilidade: Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem alterar o sinal. Reprodutibilidade. Resposta Linear: A resposta do detector deve variar linearmente com a concentração do analito numa extensa faixa de concentração. Resposta rápida a todos os analitos. Resposta independente da fase móvel. Não contribuir para o alargamento do pico: O volume da cela do detector deve ser o menor possível para evitar a perda de eficiência do sistema. Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a sensibilidade. Confiabilidade. Facilidade de manuseio com segurança. Não destrutivo: Condição necessária para cromatografia preparativa. Seletividade: Habilidade relativa de um detector medir um composto e não outro.
7. Outros : - Detector por espalhamento de luz evaporativo - ELSD. Detectores por absorbância no infravermelho. - Detectores de radioatividade. - Detector de aerossol carregado - CAD. -
Problemas ?
1. Mudanças no tempo de retenção são geralmente devidas a problemas na bomba ou vazamento
2. Mudanças na área do pico estão geralmente associadas com injetor ou sistema de tratamento dos dados
3. Picos com cauda: interação forte com coluna, coluna suja, coluna inadequada
Sistema de Aquisição de Dados e Tratamento de Dados
1. Softwares
  1. 1. Processar os dados de cromatograma 2. Armazenar e registrar 3. Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna 4. Realizar cálculos para “Testes de Adequabilidade do Sistema” 5. Controlar o sistema de injeção 6. Gerar cromatograma
2. Hardware

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Mtodos Cromatogrficos Cromatografia De Papel Cromatografia De Camada Delgada Cromatografia De Coluna Cromatografia Gasosa Cromatografia Lquida De Alta Eficincia Clae Hplc 61 638 (image/jpeg)

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