Decalcificación de tejido óseo.

Corte de hueso
1. Las biopsias de hueso por lo general se realizan en forma ambulatoria. Usted será posicionado de manera tal que el médico pueda acceder fácilmente al hueso que va ser muestreado. Es posible que se utilice un cinturón o correa para mantenerlo en la posición correcta. Si el procedimiento se realiza con TC, usted tendrá que permanecer acostado durante el procedimiento. Se realizará una TC para confirmar el sitio en el que se hará la biopsia.
  1. Durante el procedimiento, podría estar conectado a unos monitores que controlan el latido cardíaco, la presión arterial y el pulso. Una enfermera o tecnólogo podría insertar una línea intravenosa (IV) en una vena de su mano o brazo de manera que se le puedan administrar en forma intravenosa una medicación sedativa o relajante durante el procedimiento. Asimismo se le puede proporcionar un sedante suave previamente a la biopsia. Se le inyectará anestesia local para adormecer el curso de la aguja.
    1. Se hará un corte muy pequeño en la piel, en el sitio donde se insertará la aguja de biopsia. Con la ayuda de la guía por imágenes, el médico insertará la aguja a través de la piel, la empujará hasta el hueso, y luego, a través de la primera aguja insertará una segunda aguja que removerá una pequeña muestra de la lesión hacia el interior del centro hueco.
      1. A medida que se avanza la aguja a través de la lesión, se pueden obtener imágenes adicionales por TC para monitorear el pasaje de la aguja. Luego de la toma de muestras, se quitarán las agujas. Se aplicará presión para prevenir cualquier sangrado, y la abertura realizada en la piel se cubre con un apósito. No es necesario suturar.
Decalcificadores: Tipos, Métodos, Ventajas y desventajas
1. Ácido clorhídrico No es tan rápido como el ácido nítrico pero produce menor agresión tisular y no precisa lavado post descalificación.
2. Los ácidos orgánicos Producen escasos artefactos titulares y apenas interfieren en los resultados finales de la atención Pero actúa muy lentamente requieren la renovación frecuente de líquido descalcificante por eso están indicados exclusivamente cuando la muestra es tejido óseo esponjoso y sólo contiene pequeñas espículas calcificadas
  1. En el proceso de decalcificación hay que seguir unas normas que son: 1. Para disminuir en lo posible los efectos alterativos decalcificador, la fijación debe haberse completado antes de iniciar el proceso. 2. La concentración del agente decalcificante debe ser óptima con un volumen de líquido decalcificador mínimo de 1/20 que debe ser renovado con frecuencia. 3. Para acelerar el proceso los bloques deben ser suspendidos en el centro del recipiente porque en el fondo se acumula mayor concentración de sales cálcicas. 4. La temperatura ideal para realizar la decalcificación se encuentra en torno a los 25ºC. Por encima de ésta temperatura el proceso de decalcificación se acelera pero también lo hace el de descomposición del tejido.
    1. 5. La agitación suave ya sea manual o mecánica generalmente acelera el proceso. 6. A veces la adicción de alguna resina de intercambio iónico. Al medio de decalcificación acelera el proceso porque atrapa los iones de Calcio liberados por el decalcificador químico. 7. Después de cualquier proceso de decalcificación química donde se haya empleado ácido, el exceso de éste último ha de ser eliminado mediante lavados en soluciones neutralizantes, lo mejor el agua corriente. A veces para disminuir el edema en las fibras colágenas, se da un lavado con una solución de sulfato sódico al 5%. 8. La coloración de tejidos decalcificados puede ser interferida por un exceso residual de los ácidos empleados para eliminar las sales cálcicas por este motivo a veces se tratan los cortes con una solución acuosa de carbonato de Litio al 1% para asegurar la neutralización completa.
3. SOLUCIÓN ACUOSA DE ACIDO NITRICO: Ac. Nítrico concentrado……………………………………………………….5 mL Agua destilada………………………………………………..………...…….95 mL El caso de que la solución sea alcohólica la proporción de ácido nítrico debe ser del 7.5%. El tiempo medio de decalcificación para un bloque óseo de 5mm de espesor es de 12 a 24 horas.
  1. Ventajas: 1. provoca rápida decalcificación 2. Causa baja retracción tisular. 3. Mejor coloración de los núcleos que la solución de formol y nítrico 4. No es necesario neutralizar el agente decalcificante sino que puede pasar directamente el tejido a etanol de 70º para iniciar la deshidratación.
    1. Inconvenientes: 1. La prolongación excesiva del tiempo de decalcificación suele anular la fijación previa y alterar progresivamente el tejido.
4. FORMULINA - ÁCIDO NÍTRICO: Formalina…………………………………………………….………………10 mL Ác. Nítrico concentrado………………………………………………………10 mL Agua destilada………………………………………………………………...80 mL Tiempo medio de calcificación para un bloque de tejido óseo de 5 mm de espesor es de 1 a 3 días.
  1. Ventajas: 1. Es de acción relativamente rápida. 2. Provoca menos alteraciones titulares que la solución acuosa de ácido nítrico. 3. Por su facilidad de manejo es la solución decalcificante más utilizada para técnicas histológicas de rutina.
    1. Inconvenientes: 1. Dificulta la tinción nuclear 2. Antes de su procesamiento los tejidos requieren neutralización en sulfato sódico al 5% y un lavado posterior en agua corriente al menos durante 2 horas.
5. SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁCIDO FÓRMICO: Acido fórmico al 90%...................................................................................5-10 mL Agua destilada…………………………………………………………….90-95 mL Tiempo medio para un bloque óseo de 5 mm de espesor es de 3 a 7 días.
  1. Ventajas: 1. Fija y descalcifica simultáneamente. 2. No dificulta demasiado la coloración nuclear. 3. esta especialmente recomendado para decalcificar bien
    1. Inconvenientes: 1. Acción muy lenta. 2. Requiere neutralización previa a la inclusión en sulfato sódico al 5%
6. Lavado en agua posteriormente durante 18 horas. Existen también soluciones fijadoras con poder decalcificante. Entre los más utilizados son los de los líquidos de Bouin, Bouin Hollander, y Zenker. Todo ellos poseen una débil capacidad decalcificadota por la cual se emplea casi exclusivamente como decalcificantes de los cilindros biópsicos de medulas óseas, están constituidos sobre todo por esponjosas y para eliminar pequeñas calcificaciones distróficas.
7. 4. Decalcificación con quelantes químicos Los quelantes químicos son sustancias capaces de combinarse con iones metálicos en solución o estabilizados en forma de sales o constituir nuevos compuestos generalmente solubles en agua.
  1. Sal disódica de EDTA………………………………………………………….5.5 gr. Formalina neutra al 10%................................................................................100.0 mL El tiempo medio de decalcificación para un bloque de 5mm de espesor de esponjosa ósea de 1 a 3 semanas y para un bloque de hueso cortical entre 6 y 8 semanas.
    1. La decalcificación química, puede acelerarse con el empleo de ultrasonidos. El método se fundamenta en someter el aumento una vez inmerso en la solución decalcificación a la acción de ondas ultrasónicas en un baño líquido. De esta forma se induce una vibración molecular sobre el material calificado favorece la formación de sales entre los iones desprendidos y los ácidos o querantes usados durante el proceso.
8. Decalcificación electrolítica Se basa en el empleo de una corriente eléctrica para provocar la ionización de la solución salina o decalcificante en que se encuentra sumergido el tejido de esta manera las sales insolubles de calcio presentes en el tejido son desplazadas hacia el electrodo negativo y los radicales ácidos hacia el polo electropositivo. Este proceso suele realizarse entre 30 y 45ºC y para especimenes pequeños.
  1. Se completa entre 45 y 60 minutos a pesar de las ventajas del procedimiento no se utiliza de forma rutinario en la mayoría de los laboratorios de anatomía patológica.
9. Pruebas de control sobre el grado de decalcificación tisular El control exacto del tiempo óptimo de decalcificación tisular es importante porque una duración mayor provoca maceración y destrucción celular y un acortamiento provoca el que no se puedan secciones microtómicas adecuadas. Por eso se precisan mecanismo de control que permitan establecer el control en el que el proceso sea el completado.
  1. Existen 3 tipos de métodos: 1. Físicos: que se basan en la experiencia del técnico para detectar mediante el tacto el grado de dureza y calcificación tisular, Histológicamente es muy subjetivo y puede dañar el tejido durante la manipulación por lo cual no son aconsejables. 2. Radiológicas: bastante sensibles pero requieren instrumento complejo y son costosos. 3. Químicos: son normalmente de elección y se basan en la detección de iones cálcicos en el líquido de calcificante. Cuando en los sucesivos recambios de líquido dejan de encontrarse iones cálcicos se considera que el proceso ha finalizado. La prueba más utilizada es el Oxalato Cálcico.
10. Decalcificación de bloques titulares incluidos en parafina. Durante el proceso de corte de los bloques incluidos en parafina, aparecen a menudo calcificaciones no detectadas. En estos casos graves desperfectos en la cuchilla que pueden llegar a impedir que se realicen las secciones necesarias. Este problema puede subsanarse sumergiendo el bloque en líquido de PERENYI o en el ácido fórmico al 50%. Antes de realizar el corte o bien empleando el método de LENDRUM que consiste en exponer la superficie de corte a la acción de una solución de acido clorhídrico al 2% durante varias horas.
  1. Ácido nítrico al 10%..........................................................................................40 mL Etanol absoluto……………………………………………………………..….30 mL Ácido crómico al 0.5% en agua destilada……………………………………..30 mL Centrar inmediatamente antes de su uso, el tiempo medio de decalcificación para un bloque óseo de 5 mm de espesor es de 2 a 6 días.
    1. Ventajas:  Prepara adecuadamente la tinción nuclear.  Apenas provoca maceración tisular.  No requiere neutralización previa a la intrusión tisular.
      1. Inconvenientes: 1. Actúa lentamente, por lo que no puede emplearse para trabajos de urgencia.
Inmunohistoquímica: Diferentes pruebas especificas
1. La inmunohistoquímica es una técnica utilizada para determinar la presencia y el nivel específico de proteínas celulares. IHC mide la expresión proteica utilizando especialmente anticuerpos etiquetados o marcados que se unen a las proteínas de interés. El anticuerpo se mezcla con componentes celulares de un tumor. Después de un determinado tiempo, la mezcla se enjuaga y sólo los anticuerpos que se unieron se quedan. La presencia de anticuerpos puede ser detectada utilizando un microscopio porque las áreas que se unieron al anticuerpo se verán diferentes. Las muestras con más proteínas se unirán más al anticuerpo por lo que el cambio de color aumentará. Esto permitira que la prueba no sólo revele si está presente la proteína sino una cantidad relativa de la proteína. Los resultados de la prueba se basan en la capacidad de las células teñidas o el porcentaje de células teñidas.
  1. TÉCNICA DEL PAS (Ácido Periódico Schiff) Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico (HIO4) para incrementar el número de grupos carbonilo (aldehído o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff. Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una proporción aproximada de uno por molécula de monosacárido. Precisamente por ello es necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos, que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos alcohólicos o amino.
    1. · Procedimiento Técnico: Fijación: o Formol al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin. o Ácido Periódico……………0.5 % p/v. o Reactivo de Schiff: Fucsina básica (CI: 42510)………… 1g. Agua destilada……………………... 200 ml. Disolver la fucsina en 200 ml de agua (d) hirviendo. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50º C. y filtrar Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Después enfriar hasta 25º C y añadir 1g de Bisulfito sódico o Metabisulfito potásico (sódico).
      1. Mantener en la oscuridad. El líquido tarda unos 2 días o a veces 24h en tornarse de color amarillo que indica que está listo para su uso. Añadir 2g de carbón activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color. La solución debe conservarse en el refrigerado protegido de la luz. o Baño de Ácido Sulfuroso o Agua sulfurosa: o Ácido Clorhídrico (HCl) 1N…………… 5 ml. o Metabisulfito sódico 10 %……………... 6 ml. o Agua (d)………………………………... 100 ml. o Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.
  2. Técnica de Tinción: · Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes) · Ácido periódico 0.5 %…………………………………… 5 min. · Lavar en agua (d). · Reactivo de Schiff……………………………………….. 15- 30 min. · Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa…………………… 2 min. Cada uno. · Lavar en agua corriente · Colorante de contraste · Lavar con agua corriente. · Deshidratar, aclarar y montar.
    1. Resultados: Material PAS +: rojo oscuro a magenta. B. Compuestos PAS + · polisacáridos simples: como el glucógeno y la celulosa. · Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gástrico, en glándulas del duodeno y en cápsulas bacterianas, también en intestino y estómago. · mucoproteínas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del árbol respiratorio o bronquial, también la tiroglobulina que está en el tiroides y la hormona estimulante. · Glucoproteínas del suero · Glucolípidos: como los gangliósidos y cerebros idos. C. Compuestos PAS - Los mucopolisacaridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido periódico y por eso son PAS - (ya que no aparecen los grupos carbonilos) D. Controles de la técnica del PAS.
      1. Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los resultados obtenidos, para ello suelen ser muy útiles las técnicas de bloqueo tales como las de bloqueo de grupos aldehídos en general y las de acetilación de grupos aldehídos situados en posición 1,2 glicol.
  3. TINCIÓN DE GRAM Incluyen técnicas para las bacterias gram-positivas y gram-negativas, micobacterias ácido-resistentes, hongos y parásitos. La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias. Fue diseñada por Christian Gram, un científico danés, en el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resultó todo un éxito y pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las bacterias, sino también para poder identificarlas rápidamente en una infección y seleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla. La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen (esputo, orina, pus, etcétera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacte
    1. Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificación de la amplía mayoría de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de forma diferente a cada tipo de antibióticos, por eso es una técnica útil para seleccionar el fármaco antimicrobiano inicial ante una infección. Hay que tener en cuenta que en ciertas situaciones (como la sepsis) es muy importante iniciar un tratamiento antibiótico adecuado de forma precoz, por eso la tinción de Gram se pide de urgencia en muchas ocasiones.
      1. La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán identificar, al igual que los virus. En esos casos la tinción no coloreará ningún germen. Otro aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de bacteria responsable de la infección. Para ello es necesario realizar un cultivo microbiológico que se acompaña siempre de un antibiograma para estudiar de forma exacta el antibiótico más efectivo.
Cuando hay minerales en los tejidos, como por ejemplo en el hueso, dentina, o en procesos patológicos calcificantes en tejidos blandos, es muy difícil obtener buenas secciones finas, bien sea de material incluido en parafina o de material en congelación. En estos casos el proceso histológico debe incluir un paso en el que se eliminan tales minerales denominado generalmente como descalcificación, puesto que en la mayoría de los casos se eliminan minerales de calcio.

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