LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR
1. característica principal que define este laboratorio
  1. ASEPSIA
    1. evitar la aparición de cualquier microorganismo indeseado para la conservación de la esterilidad
    2. las necesidades de asepsia dependen del tipo de material que se va a procesar
      1. DOS AREAS DE TRABAJO DIFERENTES
        laboratorio de cultivo de tejidos en general
        laboratorio de cultivo con patógenos
        requerimientos de organización
        -Reciclaje periódico
        -PNT (procedimientos normalizados de trabajo) accesibles a todo el personal
        -Llimpieza: seguir estrictamente los protocolos de limpieza
        - Reactivos y productos: utilizar medios de cultivo lo mas recientes posibles, controlando todos los pasos de su preparación.Tomar nota de los proveedores, lotes, fechas, medios...y etiquetarlo todo
        requerimientos de material
        material fungible
        microscopio de contraste de fases inventido
        centrífugas
        incubadoras de CO2
        función
        mantener la temperatura controlada ya que las células suelen resistir bien a bajas temperaturas, pero son muy sensibles a aumentos
        composición
        bombonas de CO2, circuito general, bandeja de agua, sistemas de inyección de agua estéril, recirculación de aire y filtros HEPA
        cabinas de flujo laminar
        función
        mantener el area de trabajo donde manipulamos las células libres de contaminantes
        el aire se proyecta de forma constante y lineas sin corrientesse. Filtra el aire por un filtro situado.
        - en la pared frontal: flujo horizontal
        - en el techo: flujo vertical
        tipos según su fin.
        proteger al operario
        proteger el cultivo
        proteger el medioambiente
        según la importancia de la protección de estos 3 elementos
        clase I
        protegen al operario y al medioambiente pero no al producto. Funciona como extractor
        clase II
        protegen al operario, al cultivo y al medioambiente
        según el reciclaje del aire filtrado
        tipo A
        el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado
        tipo B
        se trata de una cabina para uso general en la que se recirculariza el 30% del aire en cada ciclo, eliminándose el 70% del aire restante
        tipo 100% exhausto
        el 100% del aire de cada ciclo es eliminado
        baños termostatizados
        otros materiales
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
1. tres espacios separados
  1. zona de pretratamiento: se realiza la manipulación de las muestras y la extracción de ácidos nucleicos
  2. zona limpia: donde se prepara y se realiza la amplificación y las técnicas de PCR
  3. zona oscura: se realizan las electroforesis y la lectura de geles
2. personal
  1. debe ser el adecuado y necesario para la realización, la interpretación y puesta al día de las técnicas
3. la tecnica aseptica
  1. un código que hace que las buenas prácticas de laboratorio (BPL) sean garantía de que en su aplicación en el laboratorio de cultivos celulares eviten la contaminación, bien química, microbiología o cruzada
    1. debemos tener en cuenta
      1. - las cabinas de flujo laminar
      2. - el entorno de la llama del mechero
      3. - en entornos en donde no se pueda utilizar la cabina de flujo laminar se puede adaptar el área de trabajo emulando un ambiente estéril
4. normas de manipulación
  1. ropa: siempre uso de bata, se evitaran las sandalias y llevar los dedos al aire
  2. manos: uso de guantes, lavarse las manos antes, después y con cierta frecuencia durante el trabajo con cultivos celulares
  3. heridas: vigilarlas ya que pueden ser una puerta de entrada a la infección, cubrirse adecuadamente con material resistente al agua
  4. gafas: uso reservado para circunstancias en las que pueda haber salpicaduras, descargas de aerosoles...
  5. en el entorno alrededor del laboratorio: no salir del laboratorio con batas ni guantes, acceso restringido, sobre todo a determinadas zonas
5. equipamiento básico
  1. frigorifico y congelador
  2. pipetas automáticas de seguridad
  3. baño termostáticos
  4. termociclador
  5. centrífuga y microcentrífuga
  6. sistema de electroforesis
  7. campana de flujo laminar
  8. lector digital de geles
  9. placa térmica para realizar hibridaciones
6. manejo del material
  1. deben identificarse la tapa y el lateral de la base
  2. rotular y marcar todo el material
  3. identificar adecuadamente el contenedor
  4. evitar el pipeteo repetido de un stock de una solución
  5. hacer que los recipientes permanezcan abiertos el menor tiempo posible
  6. rechazar un material si no estamos seguros de que cumple las condiciones de esterilidad
  7. no pipetear con la boca
  8. secar cuidadosamente las botellas que han pasado por un baño para atemperarlas
  9. no abrir un recipiente que muestre signos de posible contaminación en un ambiente cercano a medios de cultivo, cultivos o aditivos
SEGURIDAD EN AMBOS LABORATORIOS
1. SEGURIDAD: estado en el que el riesgo está eliminado o limitado a un nivel aceptable. RIESGO: probabilidad de que ocurra un peligro o daño. Es la base para tomar medidas preventivas. PELIGRO: hace referencia al riego de que se produzca un daño para la salud, los materiales o el medioambiente. MEDIDA PREVENTIVA: medida o actividad que puede aplicarse para evitar o eliminar un riesgo. CONTENCIÓN: son los procedimientos que hacen seguro el manejo de material de riesgo en el laboratorio
  1. medida preventiva para evitar riesgos
    1. PNT (procedimientos normalizados de trabajo)
      1. documentos que elabora el laboratorio para describir como llevar a cabo el procedimiento al que hacen referencia
2. riesgos biológicos : los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos
3. niveles de bioseguridad: exposición a agentes biológicos
  1. laboratorio básico, con nivel de bioseguridad 1
    1. se destina a la enseñanza y a la docencia a todos los niveles y también para la investigación
      1. la mayoría de trabajos se realizan en la poyata del laboratorio al descubierto, usar EPIs, puede haber una campana de extracción de gases, se utilizan dispositivos de pipeteo, se dispondrá de una iluminación adecuada, se contará con sistemas de seguridad, es necesaria la formación continua del personal
  2. laboratorio básico, con nivel de bioseguridad 2
    1. también destinado para la enseñanza y docencia , pero se amplia su uso para la investigación y el diagnóstico clínico
      1. se incluye un símbolo de advertencia de peligro biológico, se produce el uso de equipos de seguridad, es conveniente el control de flujo del aire hacia el interior y un sistema de ventilación controlada, se dispondrá de un autoclave, se instalaran ventanas equipadas con rejillas que impidan el paso de artrópodos
  3. laboratorio de contención, con nivel de bioseguridad 3
    1. destinado también a la enseñanza, docencia, investigación y diagnostico clínico. Es necesario proteger al personal, a la comunidad y al medioambiente y deben figurar en un registro controlado por las autoridades sanitarias
      1. se controla l flujo de aire, se utilizan cabinas de seguridad biológica, existe una sala que puede precintarse para ser descontaminada, hay una entrada con doble puerta, diseñado para trabajar con microorganismos del grupo de riesgo 3, se indicará el símbolo de advertencia de peligro biológico,...
  4. laboratorio de contención máxima, co nivel de bioseguridad 4
    1. este tipo de laboratorios son unidades que manejan patógenos peligrosos, por lo que están sometidos a un control por parte de las autoridades sanitarias
      1. el acceso estará controlado, se dispondrá de un sistema de ventilación controlada, será necesaria la descontaminación de todos los afluentes de su eliminación definitiv, se emplearán procedimientos de contención primaria...
  5. ejemplos de microorganismos según el nivel de bioseguridad
    1. nivel 1: E. coli
    2. nivel 2: Salmonella spp, lentivirus (VIH)
    3. nivel 3: Mycobacterium leprae, mycobacterium tuberculosis
    4. nivel 4: virus del ébola, virus de la viruela
    5. riesgo biologico
      1. agente biologico grupo 1: probablemente cause enfermedad en el hombre, agente biológicos grupo 2: puede causar enfermedad en el hombre. Existe un tratamiento eficaz para combatir la enfermedad, agente biológico grupo 3: puede causarían enfermedad en elhombre. Tiene un tratamientoeficaz para combatir la enfermedad. Puedepropagarse, agente biológico grupo 4: puede causar una enfermedad en el hombre. No existe tratamiento eficaz para combatir la enfermedad. Puede propagarse.
4. NORMAS GENERALES DE TRABAJO
  1. LA ORGANIZACIÓN
    1. el laboratorio debe estar limpio y ordenado, debe tener una organización adecuada para facilitar el trabajo y la seguridad, se debe disponer de EPIs, los elementos de emergencia deben estar visibles y libres para su uso inmediato
  2. COMPORTAMIENTO DEL PERSONAL
    1. llevar la bata de manga larga abrochada, el pelo recogido, evitar utilizar ropa ancha y collares o colgantes, depositar los objetos personales en las taquillas antes de entrar al laboratorio, lavar las manos al entrar y salir del laboratorio, evitar el uso de lentes de contacto, no guardar alimentos y bebidas en los frigoríficos y congeladores del laboratorio, prohibido comer, beber,fumar y aplicarse productos domésticos, prohibida la entrada al laboratorio a toda persona no autorizada y sin la ropa adecuada, no salir del laboratorio con la ropa de trabajo, informar a la persona nueva en el proceso de acogida sobre las normas de trabajo
  3. PRODUCTOS Y MATERIALES
    1. utilizar solo los productos y materiales que están en perfecto estado, etiquetar los reactivos y disoluciones preparadas, no pipetear con la boca, utilizar soportes adecuados para cada material, medir la cantidad necesaria de cada reactivo, recoger los productos y materiales finalizar su uso
  4. EQUIPOS, USO Y MANTENIMIENTO
    1. revisar periódicamente las instalaciones, mantener limpieza, calibración y mantenimiento de equipos
  5. TRABAJO CON CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA (CBS)
    1. las cabinas de seguridad biológica son cabinas de flujo laminar, consideradas como equipos de protección del personal respecto al material manipulado y también para proteger el material de contaminación externa. Se crea una barrera de aire formada por la entrada de aire del local hacia una abertura frontal. Este aire es filtrado por filtros HEPA, donde un porcentaje es reciclado al área de trabajo y otro es extraído al exterior
      1. tipos
        CBS clase I
        protección personal, ambiente y material con riesgo bajo
        CBS clase II
        protección personal, ambiente y material con riesgo bajo a moderado
        CBS clase III
        protección personal, ambiente y material con riesgo alto
      2. recomendaciones
        introducir solo el material necesario para trabajar, trabajar con mecheros bunsen siempre en los lugares dentro de la cabina, usar tubos con tapón de rosca y no con tapones de algodón porque pueden desprender fibras, realizar movimientos lentos en el interior de la cabina para no producir turbulencias, trabajar entre 5cm y 10cm de la superficie de trabajo porque es la zona mejor descontaminada
      3. protocolo de trabajo
        poner en funcionamiento la cabina entre 15 y 30 minutos antes del trabajo, desinfectar con alcohol isopropílico al 70% la superficie de trabajo, cargar la cabina con el material necesario para trabajar previamente descontaminado con alcohol, empezar a trabajar en la cabina y al terminar el trabajo en la cabina, desinfectar y dejar 15min a la cabina en funcionamiento antes de apagarla o volver a usarla y conectar la luz UV
    2. TRABAJOS CON CULTIVOS CELULARES
      1. los cultivos celulares generalmente no presentan un riesgo para el personal, pero pueden producir una inflamación local en caso de inoculación. El riesgo principal es consecuencia de la contaminación accidental. La contaminación por líneas celulares es frecuente en el laboratorio y se produce por unos hábitos de trabajo incorrectos. La contaminación por parásitos intracelulares también puede ser un riesgo
      2. recomendaciones
        trabajar con buenas prácticas microbiológicas, tratar todos los cultivos como potencialmente infecciosos, trabajar siempre dentro de una cabina de seguridad biológica del tipo II, manipular los cultivos celulares de origen humano con un nivel de bioseguridad tipo II, trabajar siempre con material estéril, limpiar y descontaminar cualquier derrame del cultivo inmediatamente, utilizar EPIs, no trabajar con mas de una linea a la vez en la CBS, descontaminar la CBS, usar medios y reactivos diferentes, renovar periódicamente la linea del stock congelado, comprobar las características y la contaminación de cada linea celular cada 1 o 2 meses, obtener lineas celulares de organismos fiables, comprobar si la linea celular tiene un comportamiento diferente, incorporar la autentificaron de las lineas celulares en la practica diaria e implantar programas de vigilancia de la salud del personal
TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
1. normas básicas de seguridad
  1. usar una bata distinta a la del uso general, realizar el cambio frecuente de guantes, separar las zonas de trabajo, evitar la acción de nucleares que degraden el ADN y el ARN de la muestra, no almacenar soluciones que hayan pasado por el autoclave con material no estéril, trabajar en zona limpia con las soluciones que contengan ácidos nucleicos o enzimas, almacenar los reactivos como cebadores de ADN, mantener en hielo fuera de la nevera el mínimo tiempo posible las enzimas y realizar controles positivos y negativos en cada experimento
2. GESTIÓN DE RESIDUOS EN EL LABORATORIO
  1. la gestión de residuos incluye la manipulación, el almacenamiento, el transporte y la eliminación de los residuos que se generan en el laboratorio. Todos los laboratorios deben tener un plan o un programa de gestión de residuos, debido a que es necesario y fundamental para aplicar programas de calidad en el laboratorio
    1. puntos importantes
      1. responsable, identificación/inventario de los residuos generados, reducción de residuos, almacenados y recogida, medidas de seguridad, actuación en caso de accidentes y formación continua del personal
        recomendaciones
        evitar el contacto con los residuos mediante EPIs, manipular siempre los residuos como peligrosos si no conocemos sus características, informar de forma adecuada y actualizada sobre la peligrosidad de las sustancias, manejar la información suficiente para realizar el trabajo de manera segura, disponer de formación en buenas prácticas de trabajo, no mezclar nunca residuos sólidos con líquidos, no eliminar por el desagüe o tirar a la basura ningún residuo químico peligroso, no llenar envases mas del 90% de su capacidad, utilizar los envases según las especificaciones técnicas para cada residuo, todos los envases deben tener escrito CEE para estar homologados, solo abrir el envase para añadir el residuo correspondiente, , evitar el apiñamiento de los envases, situar los envases y los contenedores en un lugar donde se facilite su acceso, se prohíbe el almacenamiento de residuos mas de 6 meses
        algunos de los residuos son peligrosos para la salud o el medioambiente, aunque la cantidad sea muy pequeña
        residuos no peligrosos
        de origen mineral asimilables a urbanos
        residuos especiales
        de origen mineral tóxicos o peligrosos
  2. OPERACIÓN/MEDIDAS PREVENTIVAS
    1. laboratorio de citogenética
      1. ACTIVIDAD: trabajo con cultivos celulares, manejo de agentes desinfectantes, manejo de disolventes, manejo de colorantes, cada vez que se obtengan nuevas muestras de pacientes RIESGO: contaminación del personal y del medioambiente, salpicaduras, inhalación y vertidos, contaminación del personal EPI: CSB, guantes, bata, protección barrera... MEDIDA PREVENTIVA: usar EPI, seguir las normas generales y específicas y conocer el PNT, renovar periódicamente las lineas celulares, comprobar si la linea celular tiene comportamiento diferente e incorporar autentificaron de lineas celulares en practica diaria,, manejar correctamente el desinfectante, seguir las normas generales de manejo de disolventes, normas generales de manejo de colorantes, realizar PNT de muestras con riesgo de contaminación del personal y del medoambieente
    2. laboratorio de biologia molecular
      1. ACTIVIDAD: extracción, amplificación y electroforesis de ácidos nucleicos, manipulación de enzimas de restricción y polimerasas RIESGO: contaminación cruzada y degradación de muestras, degradación del ADN y del ARN de la muestra por las nucleares, inactivacion de las enzimas EPI: guantes y CSB, MEDIDA PREVENTIVA: separar las zonas de trabajo para evitar la contaminación, realizar un proceso correcto en el autoclave, no almacenar soluciones pasadas por el autoclave con material no estéril, trabajar siempre en zonas limpias o CSB, almacenar reactivos específicos, manipular con cuidado enzimas de restricción y polimerasas y trabajar en hielo con las enzimas si están fuera de la nevera
    3. laboratorio general
      1. ACTIVIDAD: uso de pipetas automáticas RIESGO: fallo de precision de la pipeta, evitar perdidas de líquidos viscosos, contaminación de las soluciones, contaminación del émbolo de la pipeta MEDIDA PREVENTIVA: presionar el émbolo hasta el primer tope, succionar y dispensar hasta el segundo tope, usar una punta por cada componente, introducir solo la punta, nunca la pipeta, pipetear despacio y usar puntas con filtros

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