El contacto secundario después de la divergencia alopátrica explica la especiación aviar y la alta diversidad de especies en las montañas del Himalaya-Hengduan

1. Captura mediante red de niebla (19 a 41 individuos)
2. Toma de muestra
   1. Plumas - sangre, - tejido muscular
   2. Extracción de ADN genómico
      1. Amplificación de 9 a 11 loci autosómicos
         1. 35 ciclos de desnaturalización duurante 30s a 94ºC Recocido a 50-55ºC durante 40s con extensión a 72ºC durante 50s. Y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos
         2. Prueba de neutralidad mediante el multilocus Hudson-Kreitman-Aguadétest

            Annotations:

            • Supone proporciones iguaes de polimorfismo dentro de las especies y divergencia entre especies a través de los loci.
      2. Secuenciación bidireccional con cebadores
         1. Ensamble y alineación mediante Sequencher 5.4.5
         2. Reconstrucción de genotipos nucleares adicionales mediante el algoritmo PHASE
         3. Eliminación de genotipos con baja probabilidad de fase

            Annotations:

            • Pueden generar incertidumbres, así mismo, se eliminan los análisis filogenéticos y de datación posteriores.
         4. Clonación de los productos de PCR purificados
            1. En vectores de clonación TOPO TA
            2. Cinco clones al azar
               1. Se secuenciaron
         5. Aves
            1. Estimación de loci autosomico

               Annotations:

               • Mediante el método de calibración secundario descrito por Li et al. (2010). Para cada locus nuclear se calculó una relación ( R nuDNA-ND2 )

1. Redes alélicas para loci autosómicos individuales
   1. Mediante un algoritmo filogenético tradicional

      Annotations:

      • Este método exhibe buena precisión y robustez incluso frente a la migración entre especies estrechamente relacionadas.
   2. Reconstrucción de un árbol de máxima verosimilitud (ML)

      Annotations:

      • Se realizó para cada locus separado. Esto se realizó entre genotipos escalonados con éxito para cada par de especies estrechamente relacionadas en PhyML 3.0..
      1. Se utilizó el modelo de sustitución de mejor ajuste estimado en ModelTest 3.7
      2. Construcción de la red final de halotipos del árbol ML
         1. Mediante Haploviewer
         2. Perfilación de la divergencia genética general entre especies
            1. Construccioón de una red multilocus individual

               Annotations:

               • Se excluyeron de 0 a 5 individuos a los que les faltan más de tres loci, quedando entre 45 y 72 individuos para cada par de especies.
            2. Construcción de redes finales

               Annotations:

               • Se construyeron en base a matrices estandarizadas de distancias entre especies estrechamente relacionadas.
               1. Mediante el algoritmo NeighborNet de SplitsTree

Annotations:

• La coexistencia de las especies estudiadas podría haber surgido de la especiación simpátrica o del contacto secundario después de la especiación alopátrica. 

1. Mediante un modelo de algoritmo ABC

   Annotations:

   • Con el fin de comparar escenarios de divergencia alternativos. 
   1. Se construyeron dos modelos de aislamiento con migración

      Annotations:

      • Se asume que ambos modelos experimentan un crecimiento exponencial de la población después de la divergencia de especies estrechamente relacionadas.
      1. Con flujo de genes de especies estrechamente relacionadas.
      2. Sin flujo de genes de especies estrechamente relacionadas.
      3. Los parámetros de tiempo se escalaron por 4 generaciones

         Annotations:

         • Se supone un tiempo de generación de 2.5 años para las aves paseriformes.
         1. Estimación del tiempo de divergencia
            1. Modelo de BEAST

               Annotations:

               • Permite un modelo demográfico flexible (modelo lineal continuo) y supone que no hay flujo de genes durante la divergencia de especies.
               1. Se realizaron tres análisis independientes
               2. Evaluación de convergencia
                  1. Mediante Tracer 1.6
                  2. Parámetros evolutivos finales
                     1. Se infieren en base a las generaciones combinadas MCMC después de descartar el primer 10% de las generaciones

                        Annotations:

                        • El 10% descartado se toma como muestras quemadas.

1. Estimación de la superposición distributiva entre especies hermanas o especies estrechamente relacionadas

   Annotations:

   • Mediante archivos de forma distributiva descarcado del sitio web de la UICN y para probar si representaban las distribuciones reales de las especies se compilo los datos de registro de ocurrencia de eBird.