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Description
Mind Map by Eduardo Molina, updated more than 1 year ago
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Created by Eduardo Molina
almost 4 years ago
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Práctica 11
Inmunoensayo
enzimático (ELISA)
- Objetivo general
- Conocer el fundamento teórico y los usos de la
prueba de ELISA, mediante una prueba
indirecta, para interpretar los resultados y
aplicarlos en el diagnóstico serológico de
enfermedades infecciosas en medicina
veterinaria.
- Conocer el fundamento teórico y los usos de la
prueba de ELISA, mediante una prueba
indirecta, para interpretar los resultados y
aplicarlos en el diagnóstico serológico de
enfermedades infecciosas en medicina
veterinaria.
- Objetivos particulares
- 1. Realizar la prueba de ELISA
indirecta para el diagnóstico de
micoplasmosis (Mycoplasma
hyopneumoniae), mediante el
empleo de sueros sanguíneos de
cerdo para identificar reacciones
positivas y negativas.
- 2. Identificar las modalidades de la
prueba de ELISA mediante el
análisis de los fundamentos de
cada prueba para establecer sus
aplicaciones en la práctica
veterinaria.
- 1. Realizar la prueba de ELISA
indirecta para el diagnóstico de
micoplasmosis (Mycoplasma
hyopneumoniae), mediante el
empleo de sueros sanguíneos de
cerdo para identificar reacciones
positivas y negativas.
- Importancia
- La técnica de ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos
marcados con una enzima (conjugado), de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica
como enzimática. Al fijar uno de los componentes (antígeno o
anticuerpo) sobre un soporte, la reacción antígeno- anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, al adicionar el conjugado y su
sustrato específico, se producirá un color observable a simple vista
y cuantificable espectrofotométricamente.
- La técnica de ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos
marcados con una enzima (conjugado), de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica
como enzimática. Al fijar uno de los componentes (antígeno o
anticuerpo) sobre un soporte, la reacción antígeno- anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, al adicionar el conjugado y su
sustrato específico, se producirá un color observable a simple vista
y cuantificable espectrofotométricamente.
- ¿DE QUÉ CONSTA LA PRUEBA DE ELISA?
- Constan de los siguientes
elementos: fase sólida, antígeno,
anticuerpo, control positivo,
control negativo, conjugado,
enzima, sustrato y muestra.
- Es el analito que se puede fijar a
la fase solida; puede ser el
elemento conocido o provenir de
la muestra a determinar
(elemento
- Antígeno
- Antígeno
- Fase sólida.
- Es la placa de 96 pozos de fondo plano,
donde las moléculas de Antígenos o
Anticuerpos se unen con la superficie de la
placa a través de las fuerzas
electroestáticas. La placa puede ser de
poliestireno, cloruro de polivinilo,
polipropileno, nylon o silicona. Los
mejores resultados se obtienen con el
poliestireno y el polivinilo, por su rigidez,
transparencia y propiedades de unión.
- Es la placa de 96 pozos de fondo plano,
donde las moléculas de Antígenos o
Anticuerpos se unen con la superficie de la
placa a través de las fuerzas
electroestáticas. La placa puede ser de
poliestireno, cloruro de polivinilo,
polipropileno, nylon o silicona. Los
mejores resultados se obtienen con el
poliestireno y el polivinilo, por su rigidez,
transparencia y propiedades de unión.
- Anticuerpo.
- Al igual que el
antígeno, puede
estar fijado en la
placa (elemento
conocido) o ser
la muestra a
probar
(elemento
desconocido).
Los anticuerpos
para la técnica
de ELISA son
monoclonales o
policlonales.
- Al igual que el
antígeno, puede
estar fijado en la
placa (elemento
conocido) o ser
la muestra a
probar
(elemento
desconocido).
Los anticuerpos
para la técnica
de ELISA son
monoclonales o
policlonales.
- Control positivo. Suero con un
título de anticuerpos
conocidos y específicos contra
el antígeno. Control negativo.
Suero sin anticuerpos contra el
antígeno. Ambos controles
aseguran que la prueba está
funcionando correctamente.
- Conjugado. Antígeno o anticuerpo
unido a una enzima. Dicho
conjugado debe mantener estables
sus propiedades inmunológicas y
enzimáticas.
- Enzima. debe acoplarse fácilmente a
antígenos o anticuerpos, ser estable tanto
libre como conjugada, ser altamente
reactiva, encontrarse en estado puro,
disponible, a precio razonable y ser
segura. Las enzimas más utilizadas son
fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y
ß-galactosidasa.
- Sustrato. Es una sustancia que
modifica su estructura tras reaccionar
con su enzima específica y produce un
cambio que detectan los sistemas
colorimétricos, fluorescentes y
luminiscentes. La elección del sustrato
es de gran importancia para la
estandarización del método ELISA y
hay que tener varios factores en
cuenta, como son sensibilidad,
especificidad, facilidad de lectura y
estabilidad después de la reacción.
Requerimientos del sustrato: solubles
en agua, fácil de manipular, no
tóxicos, no mutagénicos y de bajo
costo. Los más utilizados son TMB
(3-3´-5-´- tetrametilbenzidina), ABTS
(sal diamino del ácido 2-2-azino-di-(3
etil - benzotiazolinsulfónico- 6), OPD
(O-fenilendiamina) y tolidina
- Muestra. Puede ser:
saliva, suero, plasma,
orina, heces, sangre,
etcétera.
- Constan de los siguientes
elementos: fase sólida, antígeno,
anticuerpo, control positivo,
control negativo, conjugado,
enzima, sustrato y muestra.
- Clasificación de las
pruebas de ELISA
- ELISA indirecta
- Esta modalidad se diseña para detectar los
anticuerpos que el individuo ha creado
contra el antígeno. El sistema de detección
emplea dos anticuerpos: uno primario
contra el antígeno y uno secundario
marcado con la enzima.
- Esta modalidad se diseña para detectar los
anticuerpos que el individuo ha creado
contra el antígeno. El sistema de detección
emplea dos anticuerpos: uno primario
contra el antígeno y uno secundario
marcado con la enzima.
- ELISA sándwich
- Ensayo de captura de antígeno y detección
mediante inmunocomplejos. En esta modalidad
se usan dos tipos de anticuerpo contra el
antígeno específico, uno sin marcar y otro
marcado, el primero se encuentra fijado a la
placa y el segundo se añadirá después de haber
agregado la muestra problema (antígeno).
- Ensayo de captura de antígeno y detección
mediante inmunocomplejos. En esta modalidad
se usan dos tipos de anticuerpo contra el
antígeno específico, uno sin marcar y otro
marcado, el primero se encuentra fijado a la
placa y el segundo se añadirá después de haber
agregado la muestra problema (antígeno).
- ELISA competitiva
- En esta modalidad, el anticuerpo de la muestra competirá con el
conjugado (anticuerpo marcado) por un número limitado de sitios de
unión del antígeno. Para ello, se fija a la placa el antígeno, se agrega el
suero problema y posteriormente se añade un conjugado contra el
antígeno, se adiciona el sustrato sobre el que sea capaz Práctica 11
Inmunoensayo enzimático (elisa) 117 El contenido intelectual de este
manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología de
la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en
trámite (agosto, 2018) de actuar la enzima marcadora. Habrá ausencia
de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no
encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra. La diferencia de densidad óptica es
proporcional a la concentración del anticuerpo problema en la muestra.
- En esta modalidad, el anticuerpo de la muestra competirá con el
conjugado (anticuerpo marcado) por un número limitado de sitios de
unión del antígeno. Para ello, se fija a la placa el antígeno, se agrega el
suero problema y posteriormente se añade un conjugado contra el
antígeno, se adiciona el sustrato sobre el que sea capaz Práctica 11
Inmunoensayo enzimático (elisa) 117 El contenido intelectual de este
manual pertenece al departamento de microbiología e inmunología de
la facultad de medicina veterinaria y zootecnia-unam. Registro en
trámite (agosto, 2018) de actuar la enzima marcadora. Habrá ausencia
de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no
encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el
anticuerpo presente en la muestra. La diferencia de densidad óptica es
proporcional a la concentración del anticuerpo problema en la muestra.
- ELISA indirecta
- Usos de la prueba
- Enfermedades producidas por
parásitos: babesias y tripanosomas,
Toxocara canis, toxoplasmosis,
triquinosis.
- Enfermedades
producidas
por
micoplasmas.
- Enfermedades producidas
por bacterias y sus
productos:
paratuberculosis,
brucelosis, enterotoxinas,
estreptococosis,
salmonelosis.
- Enfermedades producidas por
virus: Aujeszky, Newcastle,
fiebre aftosa, leucemia felina,
peste porcina africana, peste
porcina clásica, rinotraqueitis
infecciosa bovina, rotavirus y
artritis viral equina.
- Determinación de
hormonas,
quimiocinas,
citocinas u otros
antígenos en
muestras como
saliva, orina,
plasma, etcétera.
- Enfermedades producidas por
parásitos: babesias y tripanosomas,
Toxocara canis, toxoplasmosis,
triquinosis.
- HECHO POR: EDUARDO MOLINA
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