La cuantificación es necesaria para determinar la concentración
de proteínas en una muestra biológica
Los métodos están basados en:
La propiedad de las proteínas para
absorber la luz U.V.
La formación de los derivados
químicos
La capacidad que tienen de unir
ciertos colorantes
El análisis de las proteínas es necesario para:
Conocer una proteína concreta
Conocer la actividad específica de enzimas
Diagnóstico de enfermedades, etc.
Métodos de Absorción
A280
Rango de sensibilidad (µg)
100-3000
A205
Rango de sensibilidad (µg)
3-100
A280-A260
Rango de sensibilidad (µg)
100-3000
A235-A280
Rango de sensibilidad (µg)
25-700
A224-A236
Rango de sensibilidad (µg)
5-180
A215-A225
Rango de sensibilidad (µg)
2-45
Ventajas
No se pierden las muestras
Desventajas
Interfieren muchos
compuestos que absorben en
el UV
Métodos Colorimétricos
Lowry
A la muestra se añade un reactivo que forma un
complejo coloreado con las proteínas, siendo la
intensidad de color proporcional a la concentración
de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= ε.l.c
Rango de Sensibilidad (µg)
25-100 a 500nm
Rango de Sensibilidad (µg)
2-30 a 660nm
Rango de Sensibilidad (µg)
1-2 a 750nm
Conexión de exitación o
cálculo de la
concentración
Usar Curva estándar
Consta de
dos etapas
1. Los iones Cu2+ se unen a las
proteínas formando
complejos con los átomos de
nitrógeno. (color azul)
2. La reducción del reactivo de
Folin-Ciocalteau, por los
residuos de tirosina, actúan
sobre el cobre como
catalizador. Es amarillo que al
ser reducido por los grupos
fenólicos da lugar a un
complejo (azul intenso).
Ventajas
Tiene bastante sensibilidad
Desventajas
No todas las proteínas
reaccionan igual
Muestra muchas
interferencias como
detergentes no iónicos
BCA (ácido
bicinconínico)
Reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio
alcalino. Es la base del método analítico capaz de
monitorizar el ión cuproso. formar un complejo
púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino
Rango de Sensibilidad (µg)
0.5-10
Conexión de
exitación o
cálculo de la
concentración
Usar Curva estándar
Ventajas
Desventajas
No se mencionan
Método mas sensible
Muestra menos
interferencias
Bradford
Se basa en la unión del colorante Comassie Blue G-250 a las
proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas
una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente
de extinción mayor que el colorante libre.
Rango de Sensibilidad (µg)
1-15
Conexión de
exitación o
cálculo de la
concentración
ε595 = 81 mL/mg cm
Ventajas
Muy sensible
Rápido
Simple
Barato
Muy pocas sustancias
intervienen
Desventajas
Muestra interferencia
con detergentes
Biuret
Formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración
es directamente proporcional a la cantidad de proteínas.
Se recomienda para la cuantificación de proteínas en
preparados muy concentrados.
Rango de Sensibilidad (µg)
1000-10000
Conexión de
exitación o
cálculo de la
concentración
ε545 = 0.06 mL/mg cm
Ventajas
Bastante específico
para proteínas
Muestra pocas
interferencias
Barato
Desventajas
Tiene poca sensibilidad
Métodos Derivados
Fluorimétricos
o-ftalaldehido
Rango de Sensibilidad (µg)
1-5 λexcitación a 340 nm
Rango de Sensibilidad (µg)
λemisión a 475 nm
Coeficiente de extinción o
Cálculo de la concentración
Usar curva estándar
Ventajas
Muy sensible
Desventajas
La interferencia de aminas
contaminantes en la muestra