7750955
Description
Mind Map by Daniela Monroy, updated more than 1 year ago
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Created by Daniela Monroy
almost 8 years ago
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Extracción de DNA plasmídico
- Plásmido
- Moléculas de DNA
extracromosómico
- Características
- 1. Propio origen de
replicación y autonomia de
replicación
- 2. Sitios de clonación múltiple
- 3. Marcadores genéticos
seleccionables
- 3. Marcadores genéticos
seleccionables
- 2. Sitios de clonación múltiple
- 1. Propio origen de
replicación y autonomia de
replicación
- Moléculas de DNA
extracromosómico
- Pasos ("miniprep")
- 1. Lisis bacteriana
- 2. Precipitación de proteínas y
DNA genómico
- 3. Precipitación DNA plasmídico
- 3. Precipitación DNA plasmídico
- 2. Precipitación de proteínas y
DNA genómico
- 1. Lisis bacteriana
- Protocolo
- Cultivo de bacterias
- 1. Preparación de medio LB
+ antibiótico
- 2. Se toman colonias para
su posterior incubación
- 2. Se toman colonias para
su posterior incubación
- 1. Preparación de medio LB
+ antibiótico
- Extracción
- 1. Se toma 1 mL del cultivo y se
centrifuga en un tubo
eppendorf durante 2 minutos
(14000 rpm). Se elimina el
sobranadante
- 2. Se resuspende el sedimento de
bacterias en 250 µl Se incuba 2 min. a T
amb.
- 3. Se añade al tubo 250 µL de slc.
desnaturalizadora. Se agita por
inversión suave y se incuba por 5
min. a T amb.
- 4. Se añade 300 µL de acetato de K 3M y se mezcla.
Se incuba por 10 min. en hielo
- 5. Se centrifuga 10 min. a 14000 rpm
- 6. Con una pipeta se transfiere la fase
acuosa a otro tubo.
- 7. Sobrenadante se encuentra RNA y el DNA
plasmídico. Se precipitan con 2 volúmenes de
etanol absoluto frío. Mezclar bien por inversión y
guardar a -20ºC durante al menos 20 min.
- 8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante
30 min a 14000 rpm
- 9. Se elimina el sobrenadante por inversión. El
precipitado se lava de nuevo con 0.5 ml de etanol 70%
frío (20 min, centrifugación).
- 10. Se elimina todo el sobrenadante por inversión. El
precipitado se debe secar completamente para
eliminar los restos de etanol. El precipitado se
disuelve en 25 µl agua estéril.
- 11. Se añaden 0.5 µl de una solución de
RNasa (1 µg/ml) y se incuba 20 min a T amb.
- 11. Se añaden 0.5 µl de una solución de
RNasa (1 µg/ml) y se incuba 20 min a T amb.
- 10. Se elimina todo el sobrenadante por inversión. El
precipitado se debe secar completamente para
eliminar los restos de etanol. El precipitado se
disuelve en 25 µl agua estéril.
- 9. Se elimina el sobrenadante por inversión. El
precipitado se lava de nuevo con 0.5 ml de etanol 70%
frío (20 min, centrifugación).
- 8. Pasado este tiempo, se centrifuga durante
30 min a 14000 rpm
- 7. Sobrenadante se encuentra RNA y el DNA
plasmídico. Se precipitan con 2 volúmenes de
etanol absoluto frío. Mezclar bien por inversión y
guardar a -20ºC durante al menos 20 min.
- 6. Con una pipeta se transfiere la fase
acuosa a otro tubo.
- 5. Se centrifuga 10 min. a 14000 rpm
- 4. Se añade 300 µL de acetato de K 3M y se mezcla.
Se incuba por 10 min. en hielo
- 3. Se añade al tubo 250 µL de slc.
desnaturalizadora. Se agita por
inversión suave y se incuba por 5
min. a T amb.
- 2. Se resuspende el sedimento de
bacterias en 250 µl Se incuba 2 min. a T
amb.
- 1. Se toma 1 mL del cultivo y se
centrifuga en un tubo
eppendorf durante 2 minutos
(14000 rpm). Se elimina el
sobranadante
- Cultivo de bacterias
- Análisis
- Electroforesis
- Electroforesis
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