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Description
Mind Map by Angel Ortiz, updated more than 1 year ago
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Created by Angel Ortiz
over 7 years ago
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Practica de actividad Antioxidante
- Evaluación Cualitativa Cromatografía en Capa Fina por DPPH
- - Preparación de muestra: Pesar 0.1g de extracto y disolverlo en 5mL de metanol, agitar y sonificar si es
necesario, filtrar.
- - Preparación de plata: Aplicar 10 µL de muestra y 5 µL del estándar antioxidante quercetina,
rutina, ácido clorogenico, TBHQ, Trolox en una placa cromatográfica de silica gel 60F254.
- - Fase móvil: Acetato de etilo:ácido acético:ácido fórmico:agua
(100:11:11:26). Dejar que corra la placa hasta la marca y esperar que se
seque.
- - Revelado: Asperjar con el reactivo de DPPH a una concentración de 1mg/mL en metanol, recién
preparado protegido de la luz
- - Interpretación de los resultados: Los extractos con actividad antioxidante presentan
decoloración del DPPH (morado amarillo) en las bandas respectivas
- - Preparación de muestra: Pesar 0.1g de extracto y disolverlo en 5mL de metanol, agitar y sonificar si es
necesario, filtrar.
- Procedimiento:
- A) Preparación de solución madre: Pesar 20mg de extracto seco y agregar 1ml de metanol absoluto luego introducirlo
en el sonicador por 30 minutos, para obtener la solución madre. De esta solución madre preparar una serie de
diluciones:
- De esta solución madre preparar una serie de
diluciones
- De esta solución madre preparar una serie de
diluciones
- B) Solución de 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) 150µM en metanol: Pesar 1.7mg de reactivo de DPPH y disolver con
metanol hasta un volumen de 25ml en un balón aforado. Agitar la solución y conservar en un recipiente ámbar Por ser una
solución inestable, se recomienda preparar la solución en mismo día que se va a emplear, preparando únicamente lo
necesario.
- C) Preparación de los pozos de reacción: Utilizar microplacas de 96 pozos de fondo plano. Los pozos a utilizar deben ser
nuevos. La preparación de las placas se realiza bajo luz indirecta, tratando de proteger la reacción de la luz, la cual puede
degradar la vitamina C Se prepara una serie de pozos que contienen los reactivos que se citan a continuación (todas las
mediciones de volumen se realizan con pipetas automáticas):
- Se prepara una serie de pozos que contienen los
reactivos que se citan a continuación
- Se prepara una serie de pozos que contienen los
reactivos que se citan a continuación
- E) Para calcular el porcentaje de inhibición de cada uno de los pozos de reacción se utiliza la siguiente
fórmula
- Formula de adsorcion :esperando que valores de
porcentaje de inhibición se encuentren entre el
60-70%. La ecuación de la recta debe tener un r2 entre
0.97-0.99, para que la corrida sea aceptada.
- Formula de adsorcion :esperando que valores de
porcentaje de inhibición se encuentren entre el
60-70%. La ecuación de la recta debe tener un r2 entre
0.97-0.99, para que la corrida sea aceptada.
- :D) Distribución en la placa: En una misma placa se pueden leer cuatro muestras distribuyéndolas
adecuadamente, en la fila horizontal se colocan las repeticiones (A-C, F-H) y blanco de cada muestra
(Columna D y E); y en la fila vertical se colocan cada una de las diluciones de ensayo (1-5, 8-12). En la fila 6A y
6H va el blanco del control; en la fila 7A y 7H va el control. Observar el siguiente esquema de distribución de
muestras en una microplaca.
- Microplacas
- Microplacas
- A) Preparación de solución madre: Pesar 20mg de extracto seco y agregar 1ml de metanol absoluto luego introducirlo
en el sonicador por 30 minutos, para obtener la solución madre. De esta solución madre preparar una serie de
diluciones:
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