Inmovilización de enzima

Nós do fluxograma

• a) Inmovilización de la levadura

• 1. Añadir gota a gota 10 mL de la preparación de levadura con alginato de sodio a una solución en agitación de CaCl2 (contar las gotas que caen).

• 2. Mantener en agitación aproximadamente 5 minutos y colar las partículas de alginato de calcio.

• 3. Agregar la célula inmovilizada al medio de cultivo y realizar cinética

• b) Cuantificación de azúcares reductores por el método de DNS

• 1. Añadir a 6 tubos Eppendorf 100 µL de reactivo DNS.

• 2. En otro tubo Eppendorf, agregar las partículas equivalentes 50 µL de la solución enzimática a 30 mg/mL + 950 µL de la solución de sacarosa a 30 g/L

• 3. Inmediatamente después de mezclar la enzima con la solución de sacarosa, tomar una muestra de 100 µL.

• 4. Vaciar la muestra en uno de los 6 tubos Eppendorf que contiene 100 µL de DNS. Este tubo será el blanco o T0.

• 5. Después de mezclar la enzima con la solución de sacarosa, medir 1 min y nuevamente tomar una muestra de 100 µL.

• 6. Vaciar la muestra en otro de los 6 tubos Eppendorf que contiene 100 µL de DNS. Ese será el T1.

• 7. Seguir midiendo el tiempo, ahora para 2 min, 3 min, 5 min y 7 min después de que la reacción empezó.

• 8. Vaciar cada muestra de 100 µL tomada en un tubo con 100 µL de DNS. Se tendrán T2, T3, T4 y T5.

• 9. Llevar a ebullir los 6 tubos Eppendorf a baño María durante 5 minutos.

• 10. Colocarlos en agua fría durante aproximadamente 5 min o hasta que se enfríen.

• 11. Agregar 1 mL de agua destilada a cada tubo y vaciar el contenido en celdas.

• 12. Leer las absorbancias de las muestras a 540 nm recordando que el T0 es el blanco y registrarlas.

• 13. Almacenar las partículas restantes dentro de un tubo falcon en la solución de CaCl2 y en refrigeración a 4°C.

• Realizar los cálculos necesarios para obtener el número de partículas equivalentes a 1 mL.