SSCP

Nós do fluxograma

• Amplificación de las secuencias diana en placas de 96 pocillos

• Tome una alícuota de productos de PCR diluidos, márquelos y desalinéelos por filtración en gel

• Agregue 10 ml por pocillo de marcador TAMRA, que es el marcador dsNo 0.5 ml por pocillo de MapMarker1 1,000 TMR.

• Calentar a 90 ° C durante 3 minutos, luego enfriar a 20 ° C.

• Agregue 18 ml por pocillo de EDTA 0.5 mM

• Transfiera 2 ml por pocillo de los productos filtrados en gel a una placa de carga.

• Añadir 18 mL por pocillo de EDTA 0,5 mM

• Desalinice y elimine los cebadores / nucleótidos mediante filtración en gel a través de Sephadex G50 equilibrado con EDTA 0,5 mM en la placa MultiScreen

• Incubar la mezcla durante 5 minutos a 37 ° C, 15 minutos a 57 ° C y 10 minutos a 75 ° C.

• Transfiera 2.0 mL por pocillo de producto de PCR diluidoa una nueva placa de 96 pocillos.

• Agregue 4.0 mL por pocillo de solución de premezcla post etiquetado

• Las dos cadenas de productos de PCR se marcan con rodamina 6G (R6G) y rodamina 110 (R110), respectivamente, mediante la reacción de intercambio de ADN polimerasas.

• Agregue 10 ml por pocillo de H2O para diluir los productos de PCR dos veces.

• Amplifique las secuencias diana por PCR. El perfil térmico es de 1 min a 94 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 ° C, 0,5 min a 60 ° C y 1 min a 72 ° C.

• Agregue 3.0 mL de mezcla de cebadorde acuerdo con el diseño de la placa La concentración final es de 0.25 mM para cada cebador.

• Agregue 3.0 mL de plantilla de ADN (8.3 ng / mL) de acuerdo con el diseño de la placa para obtener una cantidad final de 25 ng de ADN por pocillo.

• Dispense 4,0 ml de solución de premezcla de PCRen cada pocillo.

• Interprete las trazas de salida utilizando QSNPlite

• Inicie la electroforesis a través de LLPDMAA en medio de pH bajo

• Agregue marcadores de ADN bicatenarios marcados con TAMRA

• Tome una parte alícuota del filtrado, dispense en un plato y agregue tampón de carga baja en sal, desnaturalice los productos y enfríelos a temperatura ambiente

• Matriz de tamizado: 10% LLPDMAA en 2x tampón TME. Temperatura para equilibrar, llenar y correr: 27°C. Relleno capilar (36 cm): 100 s. l Inyección de muestra: 2 kV durante 10 s. Separación: 15 kV durante 20 min, retraso de datos 1 s

• Ejecute la electroforesis de la matriz capilar en las siguientes condiciones :