Purificación de la enzima lactasa

Nós do fluxograma

• Purificación de la enzima lactasa

• El objetivo es aislar concentrar y estabilizar la proteína de interés. 

• Se deben eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína. 

• Las células se descongelan a temperatura ambiente, se suspende en 10mL de tampón fosfato sódico 20mM (pH 7,4, NaCl 500mM)

• Se añaden inhibidores de proteasas (impidiendo que actúen proteasas para que no se rompa la proteína)

• Para poder desnaturalizar las proteínas es necesario centrifugar el extracto crudo. 

• El objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas y virus.

• La proteína se purifica de forma selectiva. Las proteínas que contengan la etiqueta de histidina quedan unidos covalentemente a un resina que contiene níquel. 

• FASE I: CAPTURA. 

• Cuando se añade el tampón de elución, este hará que la proteína se separe de la histidina unida a la matriz por medio del níquel, y por tanto, la proteína eluya. 

• El extracto crudo se carga en una columna de afinidad de histidinas, previamente equilibrada con el tampón (fosfato  sódico 20mM, 20mM imidazol y 0,5 NaCl pH 7,4)

• Las proteínas presentes en las fracciones seleccionadas están en imidazol y por lo tanto, se dializan pasándolas a tampón fosfato sódico 20mM, y 0,5 NaCl pH 7,4

• FIN.

• FASE II O FASE INTERMEDIA.

• Se lava la columna con el tampón de equilibrado hasta que las proteínas inespecíficas eluyen.

• FASE III: FASE DE  PERFECCIONAMIENTO. 

• La mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es lograr la mayor pureza posible.