TÉCNICA WESTERN BLOT

Nós do fluxograma

• Western Blot

• Procedimiento

• Es una técnica analítica usada para detectar una proteína especifica en un extracto crudo, mediante el uso de anticuerpos

• La técnica usa tres pasos para llevarla a cabo

• 1) La separación de proteínas por peso molecular en geles de poliacrilamida  

• 2) La transferencia a una membrana o soporte sólido, que permite su manipulación

• 3) El marcaje de la proteína blanco utilizando un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario acoplado a una molécula que permite su visualización.  

• Materiales

• 1. Gel con proteínas cargadas y separadas previamente 2. Cámara de transferencia semiseca para Western blot 3. Papeles whatman No1 o 2 del tamaño del gel 4. Recipientes del tamaño del gel 5. Membrana de PVDF o nitrocelulosa 6. Bisturí o tijera 7. Fuente de poder

• CARGA Y CORRIDA DEL GEL  

• En el primer carril cargue el marcador de peso molecular. NOTA: se usan preferentemente marcadores preteñidos

• Cargue concentraciones entre 20-30 μg de proteína total o de 10-100 ng de proteína purificada y llévelos a volúmenes iguales y colóquelos en los pozos del gel SDS-PAGE

• Corra el gel durante 40 min – 1 hora a 150 V o 35mA. NOTA: El tiempo y corriente eléctrica pueden requerir optimización

• Transferencia semi-seca de las proteínas del gel a la membrana

• Después de correr el gel de poliacrilamida se deja el gel en buffer WBTB 1X

• Se equilibran las membranas de PVDF colocándolas en metanol durante 1 minuto y posteriormente se lavan con buffer WBTB 1X; si es de nitrocelulosa se coloca en el buffer WBTB 1X

• Se colocan 3 papeles whatman del tamaño de la membrana empapados de buffer WBTB 1X

• Posteriormente se coloca la membrana previamente equilibrada y lavada

• Y enseguida se coloca el gel sobre la membrana y 3 papeles whatman encima del gel.

• Se cierra cuidadosamente la cámara y se conecta a la fuente de poder.

• La transferencia de proteínas de la membrana se puede verificar usando la tinción con Rojo Ponceau S antes del paso de bloqueo o marcadores preteñidos.

• Terminando la transferencia se bloquea con Albumina bovina sérica (BSA) al 5% o con leche descremada al 5% en TBST 1X por 10min en agitación

• Se hacen 3 lavados con TBST 1X y se preparan los anticuerpos según las recomendaciones del fabricante en TBST (1:10,000, 1:5000, etc.)

• Se puede dejar toda la noche en agitación a 4°C o a temperatura ambiente 2 horas

• Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min

• Se prepara y coloca el anticuerpo secundario con las características del fabricante y se deja en agitación a temperatura ambiente 2 horas

• Se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados con TBST por 2 min

• Dependiendo de la molécula con la que este acoplado el anticuerpo secundario será el procedimiento a seguir

• Si los anticuerpos están acoplados a HRP se pueden realizar una reacción colorimétrica con Carbazol

• Agregue en un tubo de 15mL, 2.25 mL de la disolución Stock de Carbazol, y posteriormente agregue 6 mL de buffer de Acetatos y 15 µL de H2O2

• Coloque la membrana en un recipiente y posteriormente la mezcla de Carbazol y espere a que las bandas se tiñan de un color Rojo carmesí

• Western Blot 1 768x1417 (binary/octet-stream)

• Lolito (binary/octet-stream)