FUNDAMENTOS DE EVOLUCIÓN
MOLECULAR DIRIGIDA DE ENZIMAS.
se sustenta
en el denominado diseño “racional”
(mutagénesis dirigida a posiciones concretas del
catalizador, en base a modelos o estructuras
cristalográficas)
estrategia alternativa más adecuada
denominada evolución molecular
dirigida o evolución in vitro
comprime la escala temporal de la evolución
GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
eleccion de un organismo
hospedador
considerando la eficiencia de transformación, la
estabilidad del DNA plasmídico y la tasa de crecimiento.
detección de las propiedades
deseadas
selección biológica
La enzima se encuentra vinculada a la
supervivencia del hospedador (dificilmente
la enzima se sedesacopla de su funcion)
el metodo de SCREENING
método más versátil y flexible, donde cada uno de los
miembros de la librería es analizado individualmente
para la propiedad catalítica a estudiar
estudios “SEMI-RACIONALES"
método que se sitúa entre el diseño “racional” y el evolutivo. Esto se debe a que hacen uso del
análisis estructural de la enzima para la elección de los residuos a estudiar sometiéndolos a
mutagénesis saturada combinatorial y acoplando el estudio a ensayos en HTP- screening.
se suelen emplear dos alternativas para la generación de diversidad: la
mutagénesis aleatoria a partir de un único gen Métodos in vitro parental, y los
métodos de recombinación de DNA de varios
Método in vitro
Se basa en la fragmentación aleatoria del ADN mediante la acción de una ADNsa,
seguida de una reacción de PCR en ausencia de oligonucleótidos cebadores para el
reensamblaje de los fragmentos, la cual gradualmente produce secuencias
recombinadas completas con nuevas combinaciones.
Método in vivo
método sencillo, rápido y no mutagénico. En efecto, la elevada frecuencia de
recombinación y la fácil manipulación de S. cerevisiae