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Descrição
Mapa Mental por Eugenia López González, atualizado more than 1 year ago
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Criado por Eugenia López González
mais de 9 anos atrás
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Applications of fluorescence in situ hybridization
(FISH) in detecting genetic aberrations of medica
- INTRODUCCIÓN
- FISH- usada para la detección de anormalidades cromosómicas
- Mejoras en las técnicas citogenéticas (en últimos 30 años) = detección cada vez más sensible del cromosoma.
- Avances en el diagnóstico e investigación de las neoplasias
malignas hematológicas y tumores.
- Avances en el diagnóstico e investigación de las neoplasias
malignas hematológicas y tumores.
- Técnicas de bandeo cromosómico: revolucionaron el análisis
citogenético y han sido fundamentales en la comprensión de los
cambios genéticos en enfermedades, constitucionales y adquiridas.
- Introducción de FISH- finales de1980. Técnica que puede detectar fácilmente las trisomías y translocaciones en los
diferenciales en metafase y núcleos en interfase utilizando enteras bibliotecas de ADN del cromosoma específico.
- Alta sensibilidad, especificidad y velocidad con que
los ensayos pueden realizarse
- Primeras aplicaciones de FISH: ’Pintado Cromosómico’. Hibridación competitiva
usando bibliotecas enteras del cromosoma específico como pruebas, y el DNA
genómico humano como el competidor.
- La aparición del Proyecto Genoma Humano: impulso a las estrategias de mapeo de
genes e identificación de los puntos de interrupción de translocations.
- Primera translocación específica identificada en neoplasia humana: t (9; 22) (q34; q11) que resulta en el
cromosoma Philadelphia.
- Objetivo: ADN nuclear de cualquiera de las células en interfase o de los cromosomas
en metafase fijadas en un portaobjetos de microscopio
- FISH: puede realizarse usando médula ósea o frotis de sangre periférica.
- Una vez fijada a un portaobjetos de microscopio, las células deseadas se hibridan con una sonda de
ácido nucleico. Este hibrida con su secuencia complementaria en el ADN de muestra y se marca con
una molécula informadora que es un fluorocromo adjunto, que permite la detección directa de la sonda
a través de una señal de color en el sitio de hibridación visualizado por microscopía de fluorescencia.
- Método basado en inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la sonda que se basa en la unión de anticuerpos a antígenos
específicos, el anticuerpo una vez que se produce una unión de antígeno, se demuestra con una reacción histoquímica de color
visible por microscopía de luz o fluorocromo con luz UV.
- FISH- usada para la detección de anormalidades cromosómicas
- ABERRACIONES
GENÉTICAS
- Cromosomas composición: ADN, histonas
,proteínas no histonicas y se organizan
durante la interfase en dominios.
- Acción de topoisomerasas: promover la recombinación
ilegítima que conlleve a aberraciones cromosómicas
- Formación de aberraciones cromosómicas: pueden
ocurrir en celulas somáticas y la línea germinal.
- Mutaciones: pueden ocurrir en los genomas de todas las células que se
dividen como resultado de la incorporación errónea durante la
replicación del ADN o mediante la exposición a mutagenes exógenos
tales como la radiación ionizante o mutagenes endógena
- Ciertos tipos de aberraciones cromosómicas son letales
- Otras aberraciones pueden conducir a la transformación oncogénica
por la inactivación de un gen supresor de tumores o la activación de
un oncogén a través de la generación de nuevas proteínas de fusión
capaces de iniciar la carcinogénesis.
- El aumento de frecuencias de aberraciones mal cromosómicas se
correlacionan con riesgos elevados de cáncer y ciertas neoplasias humanas
están asociadas con aberraciones cromosómicas definidas marca
aberraciones cromosómicas un sello distintivo de toda celulas tumor
- Mecanismos moleculares para aberraciones cromosómicas:
aún no se entienden completamente.
- Hay de dos clásica y moderna.
- Otros tipos de aberraciones cromosómicas: translocaciones e
inversiones recíprocas normalmente no son reconocibles con la
tinción de Giemsa, pero pueden ser visualizados por FISH.
- Cromosomas composición: ADN, histonas
,proteínas no histonicas y se organizan
durante la interfase en dominios.
- PRUEBAS
- Potencial de FISH: es mayor por la detección
multicolor de simultáneamente sondas hibridadas.
- 3 tipos de sondas: de pintura de todo el cromosoma;de
secuencias repetitivas y de pruebas específicas del locus
- “Pintado cromosómico” hibridación de marcado con
fluorescencia específicos del cromosoma.Sondas de
pintura: no útiles en el análisis de las células en
interfase porque los dominios de señal son tan grandes
- 2 técnicas de FISH independientes, multi-color FISH (M-FISH) y
cariotipo espectral (SKY). Ambos han sido muy valiosa en las
aplicaciones de diagnóstico e investigación.
- Sondas de secuencias repetitivas hibridan específica
regiones o estructuras que contienen secuencias
cortas que están presentes en muchos miles de
copias cromosómicas.
- Sondas específicas de locus: son por lo general clones genómicos,
particularmente útiles para detectar estructural reordenamientos
como translocaciones cromosómicas específicas, inversiones o
deleciones en tanto metafase y interphase.
- FISH multicolor:identificado en células
por medio de sondas genómicas que se derivan de los
puntos de interrupción translocaciones recurrentes.
- tipos de sondas de doble color: de translocación, de
reordenamiento 'Split-apart' y para detección de eliminación.
- Potencial de FISH: es mayor por la detección
multicolor de simultáneamente sondas hibridadas.
- MULTIPLEX FISH
- FISH: capacidad de identificar varias
regiones o genes simultáneamente ,
utilizando diferentes colores.
- M- FISH (y SKY) permiten que la pintura de todo
el complemento cromosómico en una sola
hibridación a través de etiquetar cada cromosoma
con una combinación diferente de fluoróforos
- M-FISH y SKY difieren en el método utilizado para
discriminar las sondas marcadas diferencialmente.
- SKY utiliza un sistema de imagen
dedicado que incorpora un
dispositivo de chargecouple enfriada
(cámara CCD) y espectrometría de
transformada de Fourier para
analizar la firma espectral en cada
píxel de la imagen.
- M-FISH utiliza conjuntos de filtros de paso de banda de
fluorescencia estrechas específicas para reducir la diafonía
y el equipo de imágenes digitales como parte de un
microscopio de epifluorescencia convencional, con el
software informático adecuado. Principales aplicaciones de
M-FISH: caracterización de translocaciones desequilibradas,
reordenamientos cromosómicos complejos y marcadores
cromosomas en tumores sólidos.
- SKY utiliza un sistema de imagen
dedicado que incorpora un
dispositivo de chargecouple enfriada
(cámara CCD) y espectrometría de
transformada de Fourier para
analizar la firma espectral en cada
píxel de la imagen.
- FISH: capacidad de identificar varias
regiones o genes simultáneamente ,
utilizando diferentes colores.
- ¿POR QUÉ FISH?
- Ampliado capacidades de citogenética y laboratorios de patología a
través de su alta sensibilidad, especificidad y rápida rotación con una
alta eficiencia de acción de hibridación y detección
- Material: se puede procesar en 4 - 24 h
- Análisis: de 1000 - 2.000
células a cabo en de 15-45 min
- Posibilidad de estudiar las aberraciones cromosómicas en las células que no
se dividen , lo cual es útil para la visualización de las aberraciones
cromosómicas directamente en preparaciones citológicas y secciones de tejido.
- M-FISH (y otras tecnologías de FISH multicolor) sobresalen en la
caracterización de translocaciones desequilibradas, reordenamientos
cromosómicos complejos y marcadores cromosomas
- Cada técnica de FISH tiene ventajas únicas y aciones en límites de detección
de determinadas aberraciones genéticas dentro de las muestras clínicas.
- Ampliado capacidades de citogenética y laboratorios de patología a
través de su alta sensibilidad, especificidad y rápida rotación con una
alta eficiencia de acción de hibridación y detección
- ASPECTOS NEGATIVOS
- SKY y M-FISH sólo puede detectar aberraciones genéticas conocidas,
proporcionando la sonda específica está disponible (en otras palabras,
una sonda para un aberración genética conocida tiene que ser
hibridada con la muestra a fin de que la técnica de FISH para indicar
la presencia o ausencia de esa aberración genética específica solo).
- Análisis FISH con sondas específicas locus- o bibliotecas de ADN del cromosoma
específico está restringido al cromosoma objetivo o cromosómica subregión.
- FISH no puede servir como una prueba de detección de reordenamientos cromosómicas
como la mayoría de las técnicas de FISH sólo puede detectar imbalances.
- SKY y M-FISH pueden detectar anomalías del cariotipo de forma simultánea, pero ambas técnicas
dependen de sondas fluorocromo combinados. No son útiles para distinguiendo reordenamientos
intracromosomal como duplicaciones, deleciones o inversiones.
- Debido a las limitaciones en la resolución , el análisis FISH
puede no detectar microdeleciones menor que 190 kb.
- SKY y M-FISH sólo puede detectar aberraciones genéticas conocidas,
proporcionando la sonda específica está disponible (en otras palabras,
una sonda para un aberración genética conocida tiene que ser
hibridada con la muestra a fin de que la técnica de FISH para indicar
la presencia o ausencia de esa aberración genética específica solo).
- HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA
- GCH: écnica citogenética mediante la cual es posible identificar y analizar
alteraciones genéticas del tipo de ganancia o pérdida de material genético en
una muestra de DNA en comparación con una muestra de referencia.
- GCH: écnica citogenética mediante la cual es posible identificar y analizar
alteraciones genéticas del tipo de ganancia o pérdida de material genético en
una muestra de DNA en comparación con una muestra de referencia.
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