1_UD 5: Técnicas de hibridación

Las técnicas de hibridación, se pueden clasificar según el criterio el medio, o soporte en el que se llevan a cabo cuales són?

Porque se caracterizan las tecnicas de hibridacion en soporte solido?

Porque se caracterizan las tecnicas de hibridaccion in situ?

Porque se caracterizan las tecnicas de hibridacion en medio liquido?

Técnicas en medio solido

Técnica en medio líquido:

Las técnicas de hibridación In situ són: La [blank_start]fluorescente[blank_end] (FISH) y la [blank_start]Cromogenica[blank_end] (Cish)

El Dot Blot, utiliza membranas de:

En el Dot Blot, la mezcla compleja de ADN y ARN, no aporta ninguna información adicional.

En el Dot Blot, que tipo de gota se coloca directamente en la muestra que se va a analizar?

El Dot Blot, no permite un estudio simultaneo de varias muestras.

En el Dot Blot, la técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente las [blank_start]membranas[blank_end] con los reacitovs por inmersion de [blank_start]cubetas[blank_end], en [blank_start]bolsas de plastico termosellables[blank_end] o con cierre hermético o en [blank_start]frascos con tapón de rosca[blank_end].

En las técnicas de hibridación se sigue un protocolo genérico que comienza con: 1. [blank_start]La aplicación de la membrana[blank_end], 2. [blank_start]Prehibridación[blank_end], 3. [blank_start]Hibridación[blank_end], 4.[blank_start]Lavado de Posthibridación[blank_end] y 5. [blank_start]Detección del híbrido[blank_end].

En el Dot Blot, en la fase de aplicación de la muestra al soporte. No hace falta que humedecemos la membrana que actua de soporte.

En el Dot Blot, en la fase de aplicación de la muestra al soporte. Humedecemos la membrana mediante inmersión durante 10 minutos en:

En el [blank_start]Dot Blot[blank_end], en la fase de Aplicación de la muestra al soporte, cuando ya hemos humectado la membrana, se retira el exceso de este colocando la membrana [blank_start]entre dos hojas de papel de fieltro[blank_end].

En el Dot Blot, el sistema de vacío, consta de [blank_start]una plantilla con pocillos[blank_end] numerados para realizar y poder localizar las aplicaciones, debajo de la cual se sitúa la [blank_start]membrana de nitrocelulosa o nailon[blank_end] humedecida y una [blank_start]junta selladora[blank_end] para evitar la contaminación cruzada entre muestras. Este conjunto se sitúa sobre una [blank_start]cámara colectora[blank_end] que va conectada a [blank_start]vacío[blank_end].

En el Dot Blot, el proceso de aplicación de la muestra varía para ADN y ARN

Introduce los nombres

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. Las muestras de ADN, deben ser desnaturalixadas antes de su aplicación a la membrana. Para ello, las muestras con que se incuban? Durante 100ºC a 10 minutos.

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. Las muestras desnaturalizadas, se tienen que naturalizar con un volumen igual de acetato de amonio 2M a pH 7,0.

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. Una vez [blank_start]naturalizadas[blank_end], se cargan en las posiciones correspondientes de la [blank_start]plantilla[blank_end] y se aplica el [blank_start]vacío[blank_end]. El [blank_start]ADN[blank_end] de la muestra queda retenido en la [blank_start]membrana[blank_end], mientras que todos los [blank_start]reactivos[blank_end] se filtran a la [blank_start]cámara colectora[blank_end].

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. Despues de la naturalización cada muestra puede ser lavada, cargando en el correspondiente pocillo: ? y filtrándolo al vacío.

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. Terminando el proceso, se desmonta el [blank_start]sistema de vacío[blank_end], se lava la membrana con SSC2x y se seca en estufa a [blank_start]80ºC[blank_end] durante [blank_start]30-120[blank_end] minutos para unir permanntamente el [blank_start]ADN[blank_end] a la membrana. Alternativamente, las muestras dispuestas sobre [blank_start]membranas de nailon[blank_end] pueden ser ancladas definitivamente a estas mediante irradiación con [blank_start]luz ultravioleta[blank_end].

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. En ARN, tambén tenemos que desnaturalizar la muestra, para evitar la formación de horquillas intractenarias que dificultarian la hibridación. En este caso el tratamiento es mas suave, cual es?

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. El lavado se realiza con la misma solución tanto si es ADN como ARN.

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. En la aplicación de [blank_start]ARN[blank_end]. Una vez extraida la membrana del sistema de vacío, se lava con SSC 2x, 0,1 % de SDS. Las membranas de nitrocelulosa se secan a [blank_start]80ºC[blank_end] y las de nailon se secan en la [blank_start]estufa[blank_end] o se irradian con [blank_start]luz ultravioleta[blank_end].

En la aplicación de la muestra, en el Dot Blot. En el ADN, las muestras se incuban con [blank_start]hidroxido sodico (NaOH)[blank_end] a concentración [blank_start]0,4M[blank_end] y [blank_start]EDTA[blank_end] a una concentración final de [blank_start]10 mM[blank_end]. En cambio en las de ARN, las muestras se incuban con un tratamiento mas suave hidroxido sodico (NaOH) a concentración [blank_start]10mM[blank_end] y EDTA a una concentración final de [blank_start]1 mM[blank_end].

En el Dot Blot, en la fase de Prehibridación. Las membranas con las muestras se incuban con una solución de prehibridación para bloquear las posibles uniones inespecificas de la sonda a la membrana. De manera que al añadir la sona esta solo se pueda unir de manera específica a la secuencia diana.