Extracción del ADN

Flussdiagrammknoten

• Purificaciòn

• Precipitaciòn 

• Lavado

• Eluciòn

• Lisis

• El buffer de lisis (L6) contiene detergentes que descomponen los fosfolípidos de las membranas (celular y nuclear), la proteinasa K rompe enlces peptídicos de las proteínas y pevienen la hidrólisis del ADN por Nucleasas y la RNasa aisla el DNA libre de RNA

• los alcoholes disminuyen la solubilidad del ADN. Tras la precipitación y centrifugación, se obtiene un pellet, que representa el ADN concentrado y en condiciones de pureza.

• Se purifica el ADN mediante la centrifugación permitiendo obtener sólo la fase acuosa del ADN y separar las membranas, evitando que otros componentes afecten los resultados del análisis.

• El ADN se eluye en 2 partes para obtener un mayor rendimiento de ADN. La recuperación del ADN en la primera elución es del 65-80% y después de la segunda elución es>95%.

• Se adiciona buffer de lavado (W4 y posteriormente W5) para retirar el etanol y demás residuos por centrifugación

• Amplificaciòn Final

• Alineaciòn 

• Desnaturalizaciòn 

• Extensiòn

• Se realiza a 95°C por 30 segundos, su objetivo es denaturalizar la cadena de ADN rompiendo los puentes de hidrógeno y así destruir las estructuras secundarias, permitiendo el acceso a los primers a la cadena molde en sus secuencias complementariias.

• Se realiza entre 55°C y 60°C por 30 a 40 segundos,ya que se genera la energía cinética necesaria para buscar la secuencia complementaria y realizar los puentes de hidrógeno con la cadena molde

• Se realiza a 70°C por un minuto ya que es la temperatura óptima para el funcionamiento de la ADN polimerasa

• Una vez se terminan los ciclos de la PCR, la reacción se somete a un ciclo más de temperatura de extención a 72°C por 5 min, permitieno que la polimeraza termine la extensión de los productos de PCR.

• Almacenamiento  Temporal

• Se realiza a 4°C por varias horas para poder conservar los productos de PCR.

• Preparaciòn de  muestras

• Cargar muestras

• Preparaciòn de soporte

• Depositar muestras

• Aplicar corriente electrica

• Visualizaciòn con  lampara UV

• Se prepara el gel de agarosa con bromuro de etidio para comprobar los resultados de la PCR

• Se añade el tampón de carga que ayuda a cargar y visualizar las muestras en el gel 

• Primero se carga un marcador y posteriormente se cargan las muestras las cuales se depositaran en el fondo gracias a que el glicerol presente en el buffe aporta densidad a la muestra

• Se rellena la cubeta con tampón tis-acético, el cual proporciona condiciones óptimas de pH para el proceso también evide que el DNA crea degradado por nucleasas

• El ADN (carga negativa) migra del polo negativo hacia el positivo

• Se comparan la migración de las muestras con la del marcador. la velocidad de migración de las moléculas de DNA es inversamente proporcional a su tamaño

• Extracción  de ADN

• PCR

• Electroforesis

• Análisis

• El rendimiento del ADN se estima por absorbancia UV a 260nm teniendo en cuenta la ley de Beer-Lambert. Si la proporción de absorbancia a 260/280 es <1.8 indica la presencia de proteínas. Si la proporción 260/230 es <2.0 es porque hay presencia de contaminantes.

• Preparación de muestra

• Al tubo de Eppendorf de 1,5 mL se le adiciona la mezcla maestra, que contiene H2O, buffer, MgCl2, dNTPS, primers y taq polimerasa y posteriormente se le adiciona el ADN genómico o cDNA.