PCR

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• PCR

• PCR en tiempo real 

• La reacción en cadena de la polimerasa, es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces en secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco en copiada fielmente.

• PCR convencional 

• Características

• Prueba de detección de la cinética de la reacción.

• Detección simultánea durante el proceso de amplificación.

• Detección de cambios mínimos en las secuencias y con cantidades pequeñas del ADN blanco.

• Prueba simultánea (amplificación y detección) con menor tiempo.

• Requerimiento de equipamiento y reactivos muy costosos.

• Características

• Prueba de detección en punto final.

• Detección por empleo de geles de agarosa, a parte de la reacción PCR.

• Poder de resolución limitado.

• Obtención de resultados en dos pasos(amplificación y detección).

• Más tiempo de obtención de resultados. 

• Mecanismo

• El ADN de doble cadena es desneutralizado (separado en cadenas en sencillas) por calor.

• los primers se unen a las secuencias compatibles en el ADN cadena sencilla.

• Los primers son extendidos por el ADN polimerasa (en dirección 5´- 3´) dando como resultado dos copiados de la molécula original de ADN doble cadena.

• ¿Cómo funciona?

• Es un variante de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación del ADN.

• Desnaturalización: En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una T° de 95°C. Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como templado para el siguiente paso.

• Hibridación: Los primers se alienan al extremo 3´del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria.

• Extensión: En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida.

• Sistemas de detección

• Fluoróforos con afinidad por el ADN: Emiten fluorescencia cuando se unen al ADN. La intensidad de fluorescencia se incrementa proporcionalmente a la concentración de ADN.

• Sondas específicas:  los sistemas de detección específicos se divide en; a) sondas hidrólisis, b) sondas sondas de hibridación, c) sondas de horquilla

• 1 (binary/octet-stream)

• 2 (binary/octet-stream)