Extracción y determinación del contenido de clorofilas a, b y total, y carotenoides en tejido foliar

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• Extracción y determinación del contenido de clorofilas a, b y total, y carotenoides en tejido foliar

• Preparar y enfriar acetona al 80% ( propanona) CH3(CO)CH3 a -10°C

• Usar la acetona fría al 80% para extraer BAJO PENUMBRA los pigmentos de interés, ya que son fotosensibles (Lichtenthaler1987).

• Ya que los pigmentos de interés pertenecen al grupo prenil, son compuestos liposolubles, que pueden ser extraidos del tejido vegetal, usando solventes orgánicos como la acetona, metanol o etanol (Lichtenthaler1987). Un posible paso adicional para la extracción de pigmentos con acetona al 80% sería extraer nuevamente con acetona al 100% para obtener por completo las sustancias menos polares.    

• Para obtener valores correctos de determinación cuantitativa de los pigmentos, el extracto se debe usar justo después de ser preparado y en caso de ser almacenado, se tiene que mantener en su forma concentrada y bajo nitrógeno (Lichtenthaler1987).   

• Material biológico: 1)0,1 g de hojas frescas sin venas Reactivos: 1) Nitrógeno líquido, 2) acetona, 3) agua destilada 4)Na2SO4 anhidro. Material analítico:  1)tubos de reacción tipo Eppendorf de 2,0 mL, 2)juego de micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL), 3)puntas para micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL), 4)vasos de precipitados, 5)celda de cuarzo para espectrofotómetro de 1 cm de paso óptico, 6)gradilla para tubos de 2,0 mL, 7)espátula, 8)mortero, 9)equipo personal de seguridad (guantes, gafas, bata de laboratorio), 10)toallas de papel absorbente, 11)agitador magnético. 12) Filtro 13)Balón aforado 14) Frasco oscuro Equipos: 1)centrífuga, 2)espectrofotómetro, 3)balanza analítica o semianalítica, 4)cabina de extracción, 5)agitador tipo vórtex, 6)tanque para transporte de nitrógeno líquido, 7)plancha de agitación. 8)Nevera a -10°C  

• Preparación de acetona-agua 80% (v/v): La acetona debe encontrarse libre de agua antes de preparar la solución al 80%. Para eliminar el agua presente en la acetona agregar 5g de un agente secante como el Na2SO4 anhidro, a un litro de acetona, dejando reposar un día completo, y posteriormente filtrar (Vogel 1989). Preparar la solución de acetona al 80% en un balón aforado, almacenar en frasco oscuro y almacenar a -10ºC para su uso inmediato.

• Colectar hojas frescas, eliminar las venas mayores y cortar en pedazos pequeños (Melgarejo, 2010).   

• En un mortero ubicado sobre cama de hielo colocar 1g del material vegetal fresco (Melgarejo, 2010).   

• Adicionar 1,5 mL de acetona 80% v/v a -10ºC y mezclar en vórtex por dos minutos asegurando el completo contacto del material vegetal con la acetona (Melgarejo, 2010).   

• Colocarla en tubos de reacción oscuros de 2,0 mL debidamente rotulados y someter al siguiente proceso (Melgarejo, 2010).   

• Del macerado y por triplicado tomar una masa de 0,1g aproximadamente (anotar el peso exacto de muestra) (Melgarejo, 2010).   

• Adicionar nitrógeno líquido sobre el material vegetal y macerar hasta obtener un polvo muy fino(Melgarejo, 2010).   

• Retirar el sobrenadante usando una micropipeta y colocarlo en el respectivo frasco ámbar, rotular y cubrir con papel aluminio(Melgarejo, 2010).   

• El sobrenadante debe quedar libre de materiales en suspensión; de ser necesario se debe filtrar o centrifugar(Melgarejo, 2010).   

• Repetir el proceso hasta obtener lavados sin coloración verde(Melgarejo, 2010).   

• Centrifugar durante tres minutos a 10000 rpm y 4ºC (Melgarejo, 2010).   

• Realizar lecturas de absorbancia a las longitudes de onda 663nm, 647nm y 470 nm(Melgarejo, 2010).   

• Aforar con acetona 80% (v/v) previamente enfriada(Melgarejo, 2010).   

• Transferir cuantitativamente el sobrenadante recuperado, que fue almacenado en el frasco ámbar, a un balón aforado de 10 ó 25 mL de acuerdo al número de lavados (Melgarejo, 2010).   

• Medir la absorbancia nuevamente a las longitudes de onda 663nm, 647nm y 470 nm(Melgarejo, 2010).   

• Si la absorbancia a 663 nm supera 0,600 realizar una dilución tomando 500 µL y llevándola a 1mL con acetona al 80% v/v(Melgarejo, 2010).   

• El blanco analítico es acetona al 80% v/v(Melgarejo, 2010).   

• El contenido de clorofilas y de carotenoides se reporta como mg de clorofila o carotenoides /g material vegetal.(Melgarejo, 2010).