Molecular Cloning

pBR322
1. Origin of replication
  1. plasmid fungsional
2. Marker
  1. biasanya resistance
    1. Ampicilin
      1. beta-laktam
        PBP mechanism
        dinding sel dihambat
        Autolisin
        cocok untuk bakteri sedang tumbuh
        penicillin-like
      2. aman
      3. Counter-attack
        Clavulanic acid
        pengalih perhatian
        competitive inhibitor
    2. Tetracycline
      1. r70s inhibitor
        tidak cocok untuk sel yg berkembang
  2. Fungsi
    1. Penanda DNA rekombinan (notes)
      Anmerkungen:
      - Andaikata ada E.coli yang mau diberi plasmid pBR322 yang disisipi gen insulin pada situs Pst I: 1. Untuk mengetahui E.coli mana yang sudah menerima plasmid: Beri tetrasiklin. Sel yang tidak menerima plasmid akan mati. 2. Untuk mengetahui E.coli mana yang menerima plasmid dengan gen insulin: replica plating dengan menggunakan Tet+ Amp+ . Sel yang mati adalah sel yang memiliki gen insulin.
      - Apa saja kemungkinan yang bisa terjadi? Bakteri bisa saja menerima: 1. Plasmid saja 2. Plasmid dengan gen sisipan 3. gen sisipan saja 4. tidak satupun
3. Plasmid
  1. Materi genetik
  2. Ekstra chromosomal
  3. double stranded circular
4. Bolivar&Rodiguez
5. Site for Restriction Endonuclease
Restriction Endonuclease
1. Jenis pemotongan
  1. sticky ends
  2. Blunt ends
    1. turn sticky to blunt
      1. destroy the ssDNA
        SI nuclease
      2. fill the ssDNA w/ complement
        only for 5' overhang
        no editing function
        Klenow fragment
2. pUC18/19
  1. Cloning vector
  2. lacZ
    1. X-gal test
  3. MCS
    1. Multiple Cloning Site
    2. banyak RE yang bisa memotong situs itu
3. Examples
  1. pst I
    1. 5' - CTGCA|G-3' 3' - G|ACGTC - 5'
      1. sticky ends
      2. 3' overhang
  2. Sal I
  3. EcoR I
    1. 5' - G|AATTC - 3' 3' - CTTAA|G - 5'
    2. 5' overhang
  4. BamH I
4. Recognition
  1. 4,6,8
    1. more specific
5. Failure
  1. Methylation
6. Isoschizomers
  1. situs sama
  2. pemotongan sama
  3. Example
    1. 5' - AT|TAAT - 3'
      1. Ase I
        Aquaspirillum serpens
      2. Vsp I
Ligase
1. Applied AFTER removing RE
2. Energy
  1. ATP
    1. phage
  2. NAD+
    1. E.coli
Examples
1. Green fluorescence Protein
  1. trigger by araC
    1. both inserted
2. one kind of bacteria possesses other ER
  1. avoid dying by its own ER
    1. Methylation
      1. hsdM
        1st inserted
    2. hsdR
      1. host specific determinant
3. Incompatibles
  1. Use adaptor

Nächster

Molecular Cloning

Beschreibung

Zusammenfassung der Ressource

Medienanhänge

ähnlicher Inhalt

	Erstellt von raifedora vor mehr als 10 Jahre