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Description
Mind Map by marina romo santamaria, updated more than 1 year ago
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Created by marina romo santamaria
almost 6 years ago
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TÉCNICAS BIOLOGÍA MOLECULAR
- PCR: técnica de clonación molecular para una
amplificación selectiva de un fragmente de DNA a
partir de una cantidad mínima de muestras
- PASOS
- DESNATURALIZACIÓN (90º - 30/60s) =
se desenrollan las hebras para que
pueda acceder la polimerasa
- HIBRIDACIÓN (45/60º - 30/60s) =
se crean unos oligonucleotidos
que actúanos como primer
- EXTENSION (72º - 1Kb/min) =
se van sintetizando los
nucleotidos
- DESNATURALIZACIÓN (90º - 30/60s) =
se desenrollan las hebras para que
pueda acceder la polimerasa
- PCR anidada: se realizan dos PCR
seguidas, los 2 oligonucleotidos
híbrida dentro de la secuencia
- ventajas
- perfecto para fragmentos
de DNA poco abundante
- menos probabilidad de
inespecificaciones, mas
ciclos
- perfecto para fragmentos
de DNA poco abundante
- aplicación
- detectar parasitos en sangre
cuando aun no hay niveles altos
- detectar parasitos en sangre
cuando aun no hay niveles altos
- ventajas
- PCR multiplex: permite amplificar
varios fragmentos de DNA a la vez
- ventajas
- más económico y rápido
- más económico y rápido
- aplicaciones
- detección de patógenos
- DNA satélite
- detección de mutaciones
- detección de patógenos
- ventajas
- PCR cuantitativa: permite ir monopolizando la
PCR segunde realiz, DNA con fluorocromos
cuya fluorescencia se puede monopolizar
- fluorescencia proporcional a la
cantidad de DNA amplificado
- podemos conocer la
cantidad de DNA
- podemos conocer la
cantidad de DNA
- Cq ó Ct (ciclo de fluorescencia):
menor Ct = antes se detecta la
fluorescencia = mayor cantidad de
DNA
- fluorocromos
- SybrGreen: agente
intercalante verde
- TaqMan: un fluoroforo
reporter y uno quencher
- molecular beacon: sondas de
horquilla, emiten al unirse al
amplicon
- SybrGreen: agente
intercalante verde
- fluorescencia proporcional a la
cantidad de DNA amplificado
- PASOS
- ELECTROFORESIS: técnica de visualización y
análisis de los productos de una reacción
- PROCESO
- Separación electroforética en un gel de
agarras teñidos con un agente intercalaste
- Agarosa frena la migración
- mayor PM = menos migra
- menos compactado = mas migra
- mayor PM = menos migra
- agentes intercalantes
- bromuro de etidio = tóxico,
fluorescencia naranja con rad UV
- Sybrsafe y Redsafe = menos tóxico
- bromuro de etidio = tóxico,
fluorescencia naranja con rad UV
- Separación electroforética en un gel de
agarras teñidos con un agente intercalaste
- PROCESO
- SECUENCIACIÓN: sirve para determinar la
secuencia de nucleótidos del DNA
- METODO sANGER / DIDEOXINUCLEÓTIDS:
se basa en la actividad de la DNA
polimerasa
- pasos
- 4 reacciones con los cuatro ddNTP
- en cada reacción una molécula
radiactiva (las cadenas están marcadas)
- se va polimerizando hasta que aparece
un ddNTP que para la reacción
- síntesis de fragmentos de distinta longitud
- electrophoresis en gel de poliacrilamida,
cada reacción en una carril
- los fragmentos cortos son los que mas
migran y llegan al final
- se lee de abajo hacia arriba
- 4 reacciones con los cuatro ddNTP
- pasos
- SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA:
sustituye radiación por fluorescencia
- pasos
- cada ddNTP esta marcado con un
fluorocromo distinto
- solo se hace 1 reacciones en vez de 4
- electroforesis capilar
- detector: para determinar el
nucleotido incorporado
- ELECTROFORETOGRAMA
- cada ddNTP esta marcado con un
fluorocromo distinto
- pasos
- SECUENCIACIÓN MASIVA O NGS (Next Generation Sequencing):
secuenciación del genoma completo basado en secuencia
fragmento de DNA de forma simultánea
- illumina (solexa)
- pasos
- DNA se fragmenta
- PCR de cada fragmento
- secuenciacion con fluorescencia
- terminado: solo permite incorporar un
nucleotido por ronda
- terminador se elimina
- ordenación de fragmentos
- DNA se fragmenta
- pasos
- illumina (solexa)
- METODO sANGER / DIDEOXINUCLEÓTIDS:
se basa en la actividad de la DNA
polimerasa
- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
tecnología de DNA recombinante
- EXONUCLEASAS
- ENDONUCLEASAS
- ENDONUCLEASAS DE REESTRICCIÓN: cortan el DNA en
secuencias específicas y crean extremos cohesivos o romos
que permiten la union de fragmentos diferentes de DNA
- sitios de reestricción: 4-8pb
palindrómicas
- enzimas de restricción: se
nombran con tres letras (la
primera en mayúscula) y un
número
- sitios de reestricción: 4-8pb
palindrómicas
- ENDONUCLEASAS DE REESTRICCIÓN: cortan el DNA en
secuencias específicas y crean extremos cohesivos o romos
que permiten la union de fragmentos diferentes de DNA
- MAPAS DE REESTRICCIÓN:
DETERMINA LA ESTRUCTURA
DEL dna
- DNA digerido con enzimas de
reestricción
- se determina la localización de cada
secuencia de restricción
- se determina la localización de cada
secuencia de restricción
- DNA digerido con enzimas de
reestricción
- EXONUCLEASAS
- SOUTHERN BLOT:
localización y análisis de
un fragmento de DNA
- pasos
- DNA se digiere con enzimas
de reestricción
- DNA fragmentado
- electrophoresis
- dsDNA se desnaturaliza a ssDNA
con NaOH y neutraliza
- DNA a una membrana
de nitrocelulosa
- incubación del DNA
marcado
- película autorradiográfica
- película autorradiográfica
- incubación del DNA
marcado
- DNA a una membrana
de nitrocelulosa
- dsDNA se desnaturaliza a ssDNA
con NaOH y neutraliza
- electrophoresis
- DNA fragmentado
- DNA se digiere con enzimas
de reestricción
- pasos
- CLONACIÓN: Colección de moléculas o de
células idénticas a una molécula de DNA
original
- vectores de clonación: moléculas de
dsDNA circular exocromosomico con
capacidad autoreplicativa
- COMPONENTES
- Origen de replicación
- marcador de selección: gen de
resistencia aun antibiótico
- sitio de inserción: donde se va insertar con un `lugar
múltiple de reestricción`con sitios de reestricción para que
se pueda digerir con mas de una enzima de reestricción
- sitio de inserción: donde se va insertar con un `lugar
múltiple de reestricción`con sitios de reestricción para que
se pueda digerir con mas de una enzima de reestricción
- marcador de selección: gen de
resistencia aun antibiótico
- Origen de replicación
- PLASMIDO
- PASOS
- DNA purificado = sin intrones
- DNA se corta con enzimas
de reestricción
- DNA # Plasmado
- se introduce en la célula
- aislamiento de clones positivos
- DNA purificado = sin intrones
- COMPONENTES
- vectores de clonación: moléculas de
dsDNA circular exocromosomico con
capacidad autoreplicativa
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