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Description
Mind Map by Leonor Pincay, updated more than 1 year ago
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Created by Leonor Pincay
about 4 years ago
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Hibridación de ácidos nucleicos
- es un proceso en el que dos cadenas de ácidos nucleicos proceden de diferentes se unen por
complementariedad de sus bases dando híbridos DNA-DNA, híbridos RNA-RNA o híbridos DNA-RNA
- Homoduplex: hÍbrido de DNA-DNA o RNA-RNA
- Heterodúplex: híbrido DNA-RNA
- Técnicas de híbridación
- Detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o
dianas (DNA o RNA) utilizando zonas marcadas
- Secuencia diana: secuencia concreta que
se pretende detectar en la muestra
problema
- Sonda: cadena de nucleótidos con secuencia
de bases nitrogenadas complementaria a la
secuencia diana
- Diferentes técnicas de
hibridación diferenciadas por:
1. El tipo de ácido nucleico
que se quiere detectar 2.El
tipo de sonda que se utiliza 3.
El tipo de marcaje de sonda 4.
El medio o soporte (sólido,
líquido o in situ) en el que se
realiza la hibridación
- Secuencia diana: secuencia concreta que
se pretende detectar en la muestra
problema
- Detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o
dianas (DNA o RNA) utilizando zonas marcadas
- Bases teóricas
- Desnaturalización del ADN
- Separación de las dos cadenas del la molécula
bicatenaria por la ruptura de los puentes de
hidrógeno entre bases complementarias
- Se desnaturalizan por efecto de
- Agentes químicos (como aumentando el
PH, la urea o la formamida)
- Agentes físicos (como el
aumento de la tº)
- El calentamiento gradual del ADN provoca que las dos
hebras se desenrollen hasta separarse totalmente.el
enfriamiento se hace lentamente ( hasta 20-30ºC) se
pueden volver a unir las cadenas y si se hace
rápidamente la renaturalización no sucede o es más
lenta por lo que quedarían disociadas.
- temperatura de fusión o Tm: Tº a la
cual la desnaturalización de la
molécula es del 50%.
- moléculas de menos de 500 pdb:
Tm aumenta con la longitud de la
cadena
- moléculas mayores de 500 pdb: la Tm
se determina por proporción de pares
de bases G=C
- moléculas grandes: cuanto mayor es
la proporción de pares G=C, mayor
Tm
- Puede variarse según los factores
- Fuerza iónica de la solución: en presencia de
cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Ca2+ o
Mg2+) en presencia de estos cationes la curva de
fusión se desplaza hacia la derecha y la Tm aumenta
- Agentes desnaturalizantes: en presencia del DMSO o la
formamida se desestabilizan los puentes de hidrógeno,
la curva de fusión se desplaza a la izquierda y la Tm
disminuye
- Porcentaje de bases no complementarias o Mismatch: una
sonda se une a una secuencia muy parecida pero con alguna
base diferente generando un híbrido imperfecto. A mayor
mismatch, menor Tm del híbrido
- Fuerza iónica de la solución: en presencia de
cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Ca2+ o
Mg2+) en presencia de estos cationes la curva de
fusión se desplaza hacia la derecha y la Tm aumenta
- moléculas de menos de 500 pdb:
Tm aumenta con la longitud de la
cadena
- El calentamiento gradual del ADN provoca que las dos
hebras se desenrollen hasta separarse totalmente.el
enfriamiento se hace lentamente ( hasta 20-30ºC) se
pueden volver a unir las cadenas y si se hace
rápidamente la renaturalización no sucede o es más
lenta por lo que quedarían disociadas.
- Agentes químicos (como aumentando el
PH, la urea o la formamida)
- Se desnaturalizan por efecto de
- Con lleva una disminución en la
viscosidad y un aumento en la A260
(Efecto hipercrómico)
- Con la representación gráfica se obtiene
las curvas de desnaturalización o de fusión
- ZONAS
- Zona A: tramo recto ,
sin pendiente, ADN en
forma de doble cadena
y absorbancia 260 nm
- Zona B: desnaturalización
progresiva del ADN,
aumento exponencial de
260 nm hasta
desnaturalización de 100%
y ADN en forma de dos
moléculas monocatenarias
- Zona C: Tº sigue en
aumento pero no hay
aumento de 260 nm ,
todo el ADN está
desnaturalizado
- Zona A: tramo recto ,
sin pendiente, ADN en
forma de doble cadena
y absorbancia 260 nm
- ZONAS
- Con la representación gráfica se obtiene
las curvas de desnaturalización o de fusión
- Separación de las dos cadenas del la molécula
bicatenaria por la ruptura de los puentes de
hidrógeno entre bases complementarias
- Renaturalización del ADN
- las dos cadenas de una molécula de ADN completamente separadas
mediante desnaturalización se vuelven a unir. Se mide por la
disminucion de la A260 nm
- Factores en la velocidad de renaturalización
- Concentración de partida del ADN: a mayor concentración del
ADN de partida mayor es la velocidad de hibridación
- Tiempo de hibridación: a mayor tiempo de hibridación mayor
probabilidad de que las secuencias complementarias se
encuentren
- Concentración de partida del ADN: a mayor concentración del
ADN de partida mayor es la velocidad de hibridación
- CURVAS DE RENATURALIZACIÓN
- representamos la fracción de ADN renaturalizado (%) frente al logaritmo de
Cot se obtiene la curva de renaturalización o curva Cot
- Cot: es una variable donde Co es la
concentración inicial del ADN en mol/L, y
t el tiempo de incubación en segundos
- Cot ½ es el valor de Cot que
corresponde a una renaturalización del
50% de las moléculas de ADN
- ORGANISMOS
- Procariotas: tienen grandes moléculas y genomas con secuencias no repetidas, la curva
tiene forma sigmoide, se puede definir facilmente le valor de cot a mayor longitud
del genoma, mayor valor de Cot ½
- Eucariotas:Tienen grandes moléculas y genomas con secuencias repetidas, la curva
tiene una secuencia escalonada formada por 3 sigmoides correspondientes a
- Las secuencias altamente repetidas: se
reasocian facilmente. Valores de cot ½
menores
- Secuencias moderadamente repetidas:
tardan en reasociarse. Valores de cot ½
medios
- Secuencias únicas: tardan más
tiempo en reasociarse. Valores de
cot ½ mayores
- Las secuencias altamente repetidas: se
reasocian facilmente. Valores de cot ½
menores
- Procariotas: tienen grandes moléculas y genomas con secuencias no repetidas, la curva
tiene forma sigmoide, se puede definir facilmente le valor de cot a mayor longitud
del genoma, mayor valor de Cot ½
- Cot: es una variable donde Co es la
concentración inicial del ADN en mol/L, y
t el tiempo de incubación en segundos
- representamos la fracción de ADN renaturalizado (%) frente al logaritmo de
Cot se obtiene la curva de renaturalización o curva Cot
- Factores en la velocidad de renaturalización
- las dos cadenas de una molécula de ADN completamente separadas
mediante desnaturalización se vuelven a unir. Se mide por la
disminucion de la A260 nm
- Desnaturalización del ADN
- Homoduplex: hÍbrido de DNA-DNA o RNA-RNA
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