Métodos diagnósticos en infectología

Criterios generales para la recolección y transporte de la muestra clínica
1. La selección de la muestra y de pruebas apropiadas para la detección de un microorganismo responsable de la enfermedad del paciente
2. Variedad de patógenos
3. Cantidad de la muestra (sangre, orina, heces, esputo, expectorado)
4. Patógenos potenciales y las pruebas diagnósticas que deben ser solicitadas.
5. Recoge una muestra representativa del área de infección en el recipiente apropiado y se transporta al laboratorio rápidamente
6. El microbiólogo tiene la responsabilidad de proporcionar unas instrucciones apropiadas y fácilmente accesibles y materiales para la recogida y el traslado de las muestras
7. Si la prueba diagnóstica es el aislamiento del microorganismo en cultivo, la muestra debe contener microorganismos viables y se deberá tener cuidado para evitar que cualquiera de los microorganismos puedan suprimir o crecer en exceso sobre el patógeno o confundir la interpretación del cultivo.
8. Las muestras deberán ser recogidas antes de la administración de antimicrobianos
9. Tiempo requerido para transportar una muestra al laboratorio
10. Control de la calidad diagnóstica
Tinciones
1. Más utilizada es la tinción de Gram
  1. 1. Hacer un extendido de la muestra sobre una laminilla y secar al aire, fijar gentilmente al calor.
  2. 2. Cubrir la laminilla con cristal violeta por 60 segundos. Enjuagar con agua.
  3. 3. Cubrir la laminilla con lugol (yodo) por 60 segundos. Enjuagar con agua.
  4. 4. Decolorar con alcohol/acetona o etanol al 95% durante 1-5 segundos y enjuagar con agua.
  5. 5. Cubrir la laminilla con safranina durante 60 segundos.
  6. 6. Dejar secar al aire la laminilla.
  7. 7. Examinar en microscopio de luz.
2. Afinidad de los colorantes empicados hacia estructuras de la pared celular, separar en dos grandes grupos bacterianos
  1. Bacterias grampositivas (resisten la decoloración con etanol/acetona) y gramnegativas
3. Existe gran cantidad de detritus o proteínas se ha utilizado la tinción con naranja de acridina
4. Con esta técnica no es posible diferenciar entre bacterias grampositivas o negativas
5. Presencia de micobacterias o Nocardia se puede utilizar la tinción alcohol-ácida que utiliza carbol-fucsina y azul de metileno como colorantes
6. Tinción de Ziehl-Neelsen
  1. Tinción primaria con carbolfucsina requiere que la laminilla sea calentada
7. Técnica de Kinyoun
  1. 1. Hacer un extendido de la muestra sobre una laminilla y secar al aire, fijar al calor a 85°C por 15 minutos.
  2. 2. Cubrir la laminilla con carbolfucsina por 2 minutos. Enjuagar con agua.
  3. 3. Decolorar con alcohol ácido (95% de etanol más 3% de HCI) hasta eliminar el colorante.
  4. 4. Cubrir la laminilla Qon azul de metileno por 20 a 30 segundos. Enjuagar con agua. Secar al aire
  5. 5. Examinar en microscopio de luz.
Utilidad de métodos moleculares
1. Hibridación con sondas
  1. Las sondas de ácidos nucleicos pueden reconocer secuencias específicas de ADN o ARN en muestras clínicas o en cultivos.
2. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (RCP)
  1. Usando iniciadores específicos
  2. La amplificación se logra repitiendo ciclos de tres pasos: desnaturalización de las cadenas de ADN. Hibridación de los iniciadores y extensión de la secuencia amplificada; los productos de amplificación sirven de substrato para el siguiente ciclo.
  3. Detección directa en muestras clínicas
    1. Chlamydia trachomatis Estreptococo del grupo A Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Papilomavirus
  4. Confirmación de cultivos
    1. Coccidioides immitis Haemophilus influenzae Histoplasma capsulatum Mycobacterium tuberculosis complex Listeria monocyfogenes
3. Detección de los productos de amplificación
  1. Por electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio.
  2. Usando marcadores de peso molecular como referencia
  3. Este método 110 sólo amplifica la detección sino que también aumenta la especificidad de la reacción.
4. El uso de la genotipificación
  1. Vigilancia y control de infecciones intrahospitalarias y en la detección de brotes comunitarios
  2. Las técnicas de tipificación se basan en amplificación inicial del producto por RCP, seguida de la generación de “huellas digitales” a partir del producto de amplificación
5. Limitaciones de los métodos moleculares
  1. El uso de estas técnicas requiere de equipos especializados que implican una fuerte inversión inicial, como termocicladores y equipos de secuenciación, equipos de electroforesis o de campos pulsados.
  2. Contar con equipos de computación y programas que permitan el análisis y comparación de secuencias o de huellas digitales, así como acceso a bases de datos disponibles en internet
La biología molecular en el diagnóstico microbiológico
1. El diagnóstico microbiológico se basa en las características fenotípicas del microorganismo como morfología y propiedades bioquímicas, que a su vez dependen del aislamiento del patógeno.
2. Identificación de secuencias de ADN específicas de cada patógeno en muestras clínicas
3. Reacción en cadena con la enzima ADN polimerasa (RCP)
4. Amplificación de ácidos nucleicos
Pruebas rápidas para la detección de anticuerpos y antígenos
1. Contrainmunoelectroforesis
  1. Requiere cantidades pequeñas del espécimen clínico (LCR. esputo, orina, suero, líquido sinovial, etc.)
  2. En un pozo se coloca el espécimen y en el otro un anticuerpo contra el antígeno que se desea detectar.
  3. Las cargas negativas del antígeno corren hacia el ánodo y las inmunoglobulinas hacia el cátodo, cuando hay antígeno en la muestra se produce una reacción antígeno-anticuerpo.
  4. Visualizándose una banda de precipitación entre los dos pozos.
2. Inmunofluorescencia directa o indirecta
  1. La IF directa es utilizada para detectar antígeno
  2. La indirecta tanto antígeno como anticuerpos
3. Aglutinación con látex
  1. Se utilizan pequeñas partículas de látex que son cubiertas con anticuerpos específicos
  2. Líquidos corporales no viscosos o extractos
  3. Aglutinación macroscópica de las partículas cuando la prueba es positiva.
4. Coaglutinación
  1. Se utiliza como soporte Staphylococcus aureus ricos productores de proteína A (cepa Cowan) que son cubiertos por anticuerpos específicos, los cuales se unen por su región Fe y dejan libre su región Fab.
5. Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
  1. Detectar antígeno o anticuerpos contra varios microorganismos tanto bacterias, virus, parásitos y hongos
Cultivos
1. Hemocultivo
  1. Diversas enfermedades se producen bacteremias
  2. Muestras sanguíneas pueden ser inoculadas en medios de cultivo enriquecidos y suplementados y que contengan un anticoagulante (polianetolsulfonato de sodio)
  3. Cada hemocultivo deberá tomarse de un acceso venoso diferente, con intervalo de 20-30 min
2. Mielocultivo
  1. En enfermedades como brucelosis, fiebre tifoidea, etc. la recuperación bacteriana es mejor cuando se realiza cultivo de aspirado de médula ósea
  2. Puncionar a nivel de la espina ilíaca posterior
3. Cultivo de líquido cefalorraquídeo
  1. Se realiza la punción con aguja (para raquianestesia) a nivel de L4-L5.
  2. Obtener un volumen aproximado de 3 a 5 mi el cual debe ser fraccionado en varios tubos
  3. Enviando una muestra a realización de citoquímico y citológico, una muestra para coaglutinación o aglutinación con látex y una muestra para cultivo.
  4. En el estudio citológico del LCR se recomienda hacer tinción de Gram y Ziehl-Neelsen.
4. Urocultivo
  1. Muestra de orina: muestra de chorro medio, con sonda transuretral, por punción suprapúbica y con bolsa colectora.
  2. Las muestras de orina deben ser procesadas dentro de los primeros 30 minutos posteriores a la toma
  3. Si se necesita almacenar temporalmente puede colocarse en refrigeración a 4°C y transportarse al laboratorio en un recipiente con hielo.
5. Cultivo de exudado faríngeo
  1. Los microorganismos que al ser aislados de faringe tienen un significado clínico son: Streptococcus pyogenes. Corynebacterium diphtheriae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis.
  2. En algunos pacientes cuando se sospecha de presencia de Bordetella sp; Haemophilus influenzae tipo B y Neisseria meningitidis se recomienda la toma de muestras nasofaríngeas
6. Cultivo de exudado bronquial
  1. Utilizado para el diagnóstico etiológico de neumonía
7. Coprocultivo
  1. Diarrea con sangre, en diarrea secretoria por la posibilidad de participación de Vibrio cholerae, en diarrea del recién nacido, diarrea en el paciente inmunocomprometido, en síndrome urémico hemolítico y como parte de estudios epidemiológicos.
  2. Detección de portadores asintomáticos de Salmonella typhi y en la etapa aguda de fiebre tifoidea.
  3. Las bacterias de importancia clínica son: Shigella sp., Salmonella sp., Campylobacter sp., Yersinia sp., Vibrio cholerae y en casos especiales Escherichia coli.

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