PCR (Reação em cadeia de polimerase

Amplificação de um segmento especifico de DNA dentro de um genoma (gene ou parte dele)
1. Reproduzir in vitro muitas cópias de um fragmento
  1. PRINCIPIOS BÁSICOS
    1. Estrutura de DNA
      1. Uso de primers c/ um grupo 3 ´OH - para adição de novos nucleotideos
    2. Produção de fita complementar
    3. Nucleot. dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
      1. Complementa o que o prime começou
    4. Condições ionicas favoraveis
    5. REAÇÃO DE PCR
      1. DNA alvo
      2. DNA polimerase
      3. os 4 dNTP (substratos para o dna polimerase)
      4. Primers/oligonucleotideos
      5. Íons de Mg
      6. Solução tampão
      7. ETAPAS DE AMPLIFICAÇÃO
        Desnaturação (melting) 94º C
        Abertura de fita de DNA/ tempo não varia nessa etapa
        Anelamento 52º C
        Temp. varia dependendo do primer
        Polimerização 72ºC
        Polimerase (Taq polimerase) se liga ao iniciador - temp. não varia
        25 a 25 ciclos
        PRODUTO DA PCR
        vVisualização em gel de agarose corado com brometo de etídeo
        PROGRESSO DA PCR
        Tac polimerase
        Termocicladores
VANTAGENS
1. Execução simples e rápida
2. Requer quantidades de pequenas de DNA
3. Elevada sensibilidade
4. Baixo custo
LIMITAÇÕES
1. Falhas de amplificação
2. Contaminação
3. Amplificação inespecifica
MODALIDADES
1. RT-PCR - reação em cadeia da polimerase pela transcriptase reversa
  1. Síntese de cRNA (RNA complementar) a partir de RNAm ; amplificação de RNAm
2. Multiplex
  1. Utilizada para amplificação de várias regiões do DNA simultaneamente (alvos multiplos)
  2. Visualização em gel de agarose: fragmentos com diferentes tamanhos
3. Nested
  1. Aumenta a sensibilidade da reação
  2. 2 conjuntos de primers
  3. O produto da 1ª amplificação é submetida a uma 2ª reação com outro par de primer mais especifico
4. Long - PCR
  1. Para ampliificar fragmentos grandes de DNA , de até 20kb
5. PCR Quantitativo
  1. determina o nivel e expressão do RNAm em celula, tecidos
  2. PCR quantitativo em tempo real - detecção da expressão de um gene a medida que o DNA dupla fita vai sendo gerado
  3. RNAm , cDNA, PCR quantitativo

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