Determinación del contenido de proteína en hojas

Nós do fluxograma

• Determinación del contenido de proteína

• Material biológico: 1)Tejido del material vegetal a analizar Reactivos: 1)Nitrógeno líquido, 2)Acetona, 3)Agua destilada, 4)Fosfato dibásico de potasio trihidratado, 5)Fosfato monobásico de potasio, 6)Fosfato monobásico de sodio trihidratado, 7)Fosfato dibásico de sodio anhidro, 7)EDTA disódico, 8)Soluciones de HCl y NaOH para ajustar pH, 9)Etanol 98 %, ácido o-fosfórico 85%, 10)Coomassie Brilliant Blue G-250, 11)Albúmina sérica bovina (Bio-Rad, protein assay standard II), 12)HCl 37 %. Material analítico: 1)Tubos de reacción tipo falcon de 15 mL  2)Tubos de reacción tipo eppendorf de 1,5 mL  3)Juego de micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL) 4)Puntas para micropipetas (rangos de 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL) 5)Vasos de precipitados 6)Celda de cuarzo de 1 cm de paso óptico para espectrofotómetro 7)Gradilla para tubos de 15 mL y de 2,0 mL  8)Espátula  9)Equipo personal de seguridad (guantes, gafas, bata de laboratorio) 10)Toallas de papel absorbente 11)balón aforado de 1,0 L 12)Agitador magnético 13)Papel aluminio. Equipos: 1)Agitador horizontal, 2)Centrífuga refrigerada, 3)Espectrofotómetro, 4)Balanza analítica o semianalítica, 5)Tanque para transporte de nitrógeno líquido, 6)Potenciómetro, 7)Plancha de agitación magnética, 8)Cabina de extracción, 9)Vórtex

• Buffer de extracción de proteínas- Fosfato de potasio 100 mM pH 7,5, EDTA-Na2 1 mM:

• Buffer de fosfato de sodio 100 mM pH 6,80, para curva de calibración:

• Agregar 100 mL de ácido fosfórico 85%

• Colorante Bradford: 

•  Aproximadamente 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 

• Disolver en 50 mL de etanol 95%

• Agitar fuertemente y en oscuridad

• Aforar a 1,0 L con agua destilada fría

• Agitar por una hora

• Filtrar dos veces

• El conjunto de reactivos se deposita en un vaso de precipitados

• 2,3135 g KH2PO4 (PM 136,09 g/mol),  7,5316 g K2HPO4.3H2O (PM 228,23 g/mol), 0,1861g EDTA-Na2 (PM 372,23 g/mol)

• Conservar en un frasco debidamente rotulado a 4 ºC.

• Aforar a 100 mL con agua destilada fría

• Ajustar a pH 6,8

• Agitar hasta disolución completa

• Disolver en 80 mL de agua destilada fría

• El conjunto de reactivos depositarlo en un vaso de precipitados

• 1,2444g de NaH2PO4.3H2O (PM 173,98 g/mol),  0,4042 g de Na2HPO4 (PM 141,96 g/mol)

• Disolver en 350 mL de agua destilada fría

• Agitar hasta disolución completa

• Ajustar pH a 7,5

• Afora a 500 mL con agua destilada fría

• Pesar en la balanza analítica

• Pesar en la balanza analítica

• Conservar en un frasco debidamente rotulado a 4 ºC.

• Pesar en la balanza analítica

• Agitar fuertemente y en oscuridad

• Conservar en un frasco ambar debidamente rotulado a 4 ºC.

• Curva de calibración: 

• Tabla+1 (binary/octet-stream)

• Agregar 800 µL de reactivo de Bradford, tapar el tubo e invertir suavemente cinco veces para evitar la formación de espuma

• Construir la gráfica: µg/µL proteína (X) Vs. A 590nm /A 450nm (Y)

• Preparación de las muestras

• Dejar en reposo por 15 minutos y determinar la absorbancia a 590 nm y 450nm (Usando como blanco el buffer)

• Macerar hojas frescas sin nervaduras con N2 líquido hasta obtener un polvo fino y conservar a -80ºC hasta su tratamiento final.

• Homogenizar con vórtex por 10 segundos

• Colocar en un tubo de reacción de 2 mL la cantidad (según la tabla) de buffer fosfato de sodio 100 mM pH 6,8

• Preparar las siguientes mezclas de reacción para la curva de calibración: 

• Posteriormente la cantidad (según la tabla) de patrón de BSA

• Se realiza para cada nivel de concentración por triplicado con un patrón de BSA 1,45 mg/mL

• Centrifugar 30 minutos a 6000 rpm y 4ºC

• Separar el sobrenadante (extracto proteico), para la determinación inmediata del contenido de proteína

• Incubar durante 1 hora sobre cama de hielo en agitador horizontal

• Homogenizar por dos minutos en vórtex sobre cama de hielo

• Adicionar sobre el macerado 5 mL de buffer fosfato de potasio 100 mM pH 7,5

• Pesar aproximadamente 0,50 g de macerado en un tubo de reacción de 15 mL tipo falcon de fondo cónico previamente rotulado. Realizar el procedimiento por triplicado

• Procesamiento de muestras

• En caso que se presenten valores por fuera de la curva de calibración se prefiere repetir el procedimiento con menos cantidad de extracto debido a que el proceso de dilución afecta la determinación.

• Interpolar en la gráfica: µg/µL proteína (X) Vs. A 590nm /A 450nm (Y)

• Determinar la absorbancia a 590nm y 450nm

• Dejar en reposo por 15 minutos

• Agregar 800 µL de reactivo de Bradford, tapar el tubo e invertir suavemente cinco veces para evitar la formación de espuma

• Colocar en un tubo de reacción de 1,5 mL, 200 µL de extracto proteico y realizar determinación por triplicado.