Procesamiento de Tejidos.

Fijación: reactivos y sustancias alternativas
1. Los fijadores además de conservar intacta la estructura durante un espacio de tiempo más o menos largo, paralizan todos los procesos orgánicos.
2. La fijación ideal se realiza entre 0ºC y 4ºC porque aunque el frío retarda la acción del fijador al contraer la pieza, también paraliza la autolisis del tejido que será más o menos rápida dependiendo por ejemplo los tejidos ricos en enzimas digestivas como el páncreas o aquellos que tienen gran cantidad de gérmenes sufran la autolisis con mayor intensidad.
3. Las soluciones fijadoras tienen por objeto precipitar las proteínas, aumentar la consistencia de los tejidos, inactivar las enzimas proteolíticas e inhibir el crecimiento bacteriano y por lo tanto, preservar la constitución química y la morfología de los componentes titulares.
4. Principios generales de la fijación
  1. No existe un método universal de fijación, por lo que un agente fijador para un tejido no tiene porque ser adecuado para otro.
  2. No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, porque fijación no equivale a conservación tisular
  3. Un defecto en la fijación nunca puede ser corregido.
  4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con grandes defectos de fijación.
5. CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA FIJACIÓN.
  1. Elección del fijador
  2. Tamaño de las muestras.
  3. Tiempo de fijación
  4. Temperatura de la fijación
  5. Almacenamiento de las muestras
  6. Lavado de las muestras fijadas
6. FIJADORES QUE CONTIENEN FORMOL
  1. Líquido de Bouin (1897): Solución muy usada como alternativo a la formalina cuando queremos fijar ciertos Tejidos como piel órganos endocrinos, testículos y tejido embrionario en general. Sin embargo no está fijado para la fijación de biopsias renales sobre los cuales provoca una severa distorsión.
  2. Fijador de Bouin-Hollander: es una variante del líquido de Bouin especialmente indicado para la fijación de los cilindros de biopsia de médula ósea cuando no es posible controlar el tiempo de fijación de la muestra en éste líquido, la conservación, puede incluso conservar las 48 horas sin que se produzca excesivo endurecimiento.
  3. Bouin alcohólico (fijador de Dubosq-Brasil): Es una alternativa de líquido de Bouin cuando la pieza que se debe fijar es relativamente voluminosa porque posee una velocidad de penetración mucho más elevada. Se utiliza también cuando se precisa una fijación específica de sustancias hidrosolubles como el glucógeno ya que evita su disolución.
  4. Fijador de Müller: Es la disolución acuosa de un fijador simple de dicromato potásico con la adición de sulfato sódico su importancia actual radica en que se emplea para fabricar los fijadores de Orth y de Zenker. Lo que llamamos solución madre.
  5. Solución stock de Orth: idéntica a la composición del fijador de Müller.
  6. Líquido de Gendre (1937): constituye una variante de la mezcla de Bouin y se la emplea con muy buenos resultados para la fijación de Glucógeno. Tras fijar, las muestras se deben lavar con varios baños de etanol al 70º. Este fijador está compuesto por: ACIDO
  7. Líquido Anatech Ltd. o Formol-zinc (1988): esta mezcla no tamponada es un excelente fijador para inmunohistoquímica. La solución tamponada se prepara agregando 1.6 gr de cloruro de zinc a 1000 ml de Formol-PBS pH 7,2.
  8. Solución de B-5 y Zenker-Formol (Liquido de Nelly): Ambas mezclas son en esencia casi idénticas. La denominación B5 corresponde en realidad a una modificación de la de Zenker. La solución de Zenker-formol contiene dicromato potásico y sulfato sódico.
  9. Solución de trabajo de B5: Esta solución es inestable debido a que el formaldehído reduce el sublimado a cloruro mercurioso y mercurio metálico que se depositan en forma de un precipitado blanco grisáceo, por este motivo y por el elevado índice de endurecimiento que posee el sublimado, el tiempo de fijación no debe superar las 4 horas.
  10. Solución de trabajo de B5: Esta solución es inestable debido a que el formaldehído reduce el sublimado a cloruro mercurioso y mercurio metálico que se depositan en forma de un precipitado blanco grisáceo, por este motivo y por el elevado índice de endurecimiento que posee el sublimado, el tiempo de fijación no debe superar las 4 horas.
Deshidratación: reactivos y sustancias alternativas
1. La deshidratación de las muestras se consigue mediante una sustitución progresiva del agua por etanol.
2. Para conseguirlo se somete a las piezas a sucesivos baños de etanol de gradación creciente, empezando por etanol 500 ó 700 y concluyendo con diferentes baños de etanol absoluto (1000), pasando por baños de etanol 960.
3. La pieza, ya deshidratada, aún no puede ser pasada a parafina ya que el etanol no es miscible con la parafina.
Aclaramiento: reactivos y sustancias alternativas
1. NEO-CLEAR (SUSTITUTO DEL XILOL)
  1. es una mezcla alifática de hidrocarburos C10-C12, que se puede usar para las mismas aplicaciones que el xileno para el examen bacteriológico, histológico y citológico de muestras de origen humano (histoprocesamiento, desparafinación y clarificación después de la deshidratación en la tinción).
  2. e trata de un disolvente no aromático que, junto con otros materiales de diagnóstico in vitro pertenecientes a nuestra cartera, hace evaluables determinadas para el diagnóstico estructuras de destino (mediante fi jación, inclusión, tinción, contratinción, montaje) en material de examen bacteriológico, histológico y citológico, como pueden ser cortes histológicos p. ej. del riñón, de un músculo, del corazón o del pulmón.
  3. Si se usa Neo-Clear® en lugar de xileno, no son necesarios cambios de método, se puede trabajar también con los mismos tiempos para las distintas etapas de trabajo. Importante es que Neo-Clear® reacciona más sensiblemente con turbidez que el xileno al agua o a las trazas de agua, esto está relacionado con la estructura de Neo-Clear®.
Incrustación: reactivos y sustancias alternativas
1. La inclusión es el proceso por el cual se incrementará la dureza y consistencia de la pieza para permitir su corte. Esto se consigue incluyendo la pieza en una sustancia que tenga la dureza y consistencia adecuada. La sustancia habitualmente utilizada en este proceso es la parafina.
2. El reto consiste en sustituir el agua que hay en el interior y exterior de las células por parafina.
3. La parafina es una sustancia que por encima de los 600C es líquida y solidifica por debajo de esta temperatura, esto facilita de difusión de la parafina por los tejidos cuando está líquida, no obstante, otro problema que hay que salvar es el hecho que la parafina es altamente hidrófoba, es decir no se puede mezclar con el agua o sustancias en medio acuoso.
4. Las muestras de tejidos están encastradas en bloques de parafina (o PEG) usando contenedores disponibles en plástico o porcelana, discos de aluminio, o en "botes hechos con papel". Cuando uses estos métodos, extiende una fina capa de aceite de parafina en la superficie antes de vaciar la parafina líquida para permitir que se desmonte más fácilmente el bloque de parafina.
5. La encastración de tejidos inhibidos con parafina se realiza más fácilmente sobre una plataforma de encastración. Esta es una superficie simple de aluminio, que tiene una de sus superficies calentadas y no la otra. Cuando está caliente, el lado calentado mantiene la parafina líquida permitiendo que el tejido pueda ser orientado.

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